Method Article
אנו מציגים שיטה לכימות הרגלת סטנטור באמצעות מנגנון מיקרו-בקרים המקושר ללוח שיכול לספק פולסים מכניים בכוח ובתדר מוגדרים. אנו כוללים גם שיטות להרכבת המנגנון והגדרת הניסוי באופן שימזער הפרעות חיצוניות.
למידה קשורה בדרך כלל למערכת עצבים מורכבת, אך יש ראיות הולכות וגוברות לכך שחיים בכל הרמות, עד לתאים בודדים, יכולים להציג התנהגויות אינטליגנטיות. במערכות טבעיות ומלאכותיות כאחד, למידה היא עדכון מסתגל של פרמטרים במערכת המבוססים על מידע חדש, ואינטליגנציה היא מדד לתהליך החישובי המאפשר למידה. Stentor coeruleus הוא אורגניזם חד-תאי השוכן בבריכה המציג הרגלה, סוג של למידה שבה התגובה ההתנהגותית פוחתת בעקבות גירוי חוזר. סטנטור מתכווץ בתגובה לגירוי מכני, שהוא תגובת בריחה לכאורה של טורפים ימיים. עם זאת, הפרעות חוזרות ונשנות בכוח נמוך גורמות להרגלה, המודגמת על ידי הפחתה הדרגתית בהסתברות ההתכווצות. כאן אנו מציגים שיטה לכימות הרגלת סטנטור באמצעות מנגנון מיקרו-בקרים המקושר ללוח שיכול לספק פולסים מכניים בעוצמה ובתדר מוגדרים, כולל שיטות לבניית המנגנון והגדרת הניסוי באופן שממזער הפרעות חיצוניות. בניגוד לגישות שתוארו לעיל לגירוי מכני של סטנטור, מכשיר זה מאפשר לכוח הגירוי להיות מגוון תחת בקרת מחשב במהלך ניסוי יחיד, ובכך להגדיל מאוד את מגוון רצפי הקלט שניתן ליישם. הבנת ההרגלה ברמה של תא בודד תסייע לאפיין פרדיגמות למידה שאינן תלויות במעגלים מורכבים.
למידה קשורה בדרך כלל למערכת עצבים מורכבת, אך יש ראיות הולכות וגוברות לכך שחיים בכל הרמות, עד לתאים בודדים, יכולים להציג התנהגויות אינטליגנטיות. במערכות טבעיות ומלאכותיות כאחד, למידה היא עדכון מסתגל של פרמטרים במערכת המבוססים על מידע חדש1, ואינטליגנציה היא מדד לתהליך החישובי המאפשר למידה2.
Stentor coeruleus הוא אורגניזם חד-תאי השוכן בבריכה המציג הרגלה, סוג של למידה שבה התגובה ההתנהגותית פוחתת בעקבות גירוי חוזר3. סטנטור מתכווץ בתגובה לגירוי מכני3, שהוא תגובת בריחה לכאורה מטורפים ימיים. עם זאת, הפרעות חוזרות ונשנות בכוח נמוך גורמות להרגלה, המודגמת על ידי הפחתה הדרגתית בהסתברות ההתכווצות3. הסטנטור המורגל עדיין מתכווץ לאחר שקיבל גירוי מכני בעוצמה גבוהה4 או גירוי פוטי5. תצפיות אלה, המתיישבות עם הקריטריונים הקלאסיים של תומפסון וספנסר להתרגלות בבעלי חיים6, מצביעות על כך שתגובת ההתכווצות המקורית נובעת מלמידה ולא מעייפות או מדלדול ATP. כתא חי חופשי, ניתן לחקור את סטנטור ללא הפרעות רבות מהתאים הסובבים אותו, כפי שקורה ברקמה רב-תאית. מספר תכונות נוספות הופכות את Stentor למערכת ניתנת למתיחה לחקר למידה: גודלה הגדול (1 מ"מ), תגובת ההרגלה הניתנת לכימותשלה 3, קלות ההזרקה והמיקרומניפולציה7, הגנוםהמרוצף במלואו 8, והזמינות של כלי הפרעת RNA (RNAi)9. שימוש באורגניזם מודל זה כדי לחקור למידת תאים ללא מוח או מערכת עצבים דורש הליך הניתן לשחזור לגירוי תאי סטנטור ומדידת התגובה.
כאן אנו מציגים שיטה לכימות הרגלת סטנטור באמצעות מנגנון המחובר ללוח מיקרו-בקר שיכול לספק פולסים מכניים בעוצמה ובתדר מוגדרים, כולל שיטות לבניית המנגנון והגדרת הניסוי באופן שממזער הפרעות חיצוניות (איור 1). הבנת ההרגלה ברמה של תא בודד תסייע לאפיין פרדיגמות למידה שאינן תלויות במעגלים מורכבים.
איור 1: הגדרת ניסוי הרגלה. לוחית הפטרי המכילה סטנטור ממוקמת על גבי סרגל המתכת הגמיש של מכשיר ההרגלה. לאחר מכן, הארמטורה של מכשיר ההרגלה פוגעת בסרגל המתכת בכוח ובתדר מוגדרים, ומייצרת גל גירוי על פני שדה התאים. מצלמת המיקרוסקופ USB מתעדת את תגובות הסטנטור לגירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סיכום של זרימת העבודה של ניסוי ההרגלה. האיור מציג את השלבים הבסיסיים הכרוכים בחקר סטנטור באמצעות מכשיר ההרגלה. הדמות נוצרה עם BioRender.com. מעובד מתוך "תרשים זרימה תהליך", על ידי BioRender.com (2022). אוחזר מתוך https://app.biorender.com/biorender-templates. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
הערה: סיכום של זרימת העבודה של ניסוי ההרגלה מוצג באיור 2.
1. הרכבת מכשיר ההרגלה
איור 3: מרכיבי מכשיר ההרגלה. כל האלקטרוניקה המסומנת נדרשת להרכבת המכונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: סכמת אלקטרוניקה. זהו המעגל על לוח הלחם. החוטים המתחברים ללוח המיקרו-בקר ממוספרים כמתואר בפרוטוקול. D1 ו-D2 הן נוריות LED אדומות וירוקות, בהתאמה, ומחוברות לקרקע באמצעות 330 נגדי Ω. שני המתגים נמשכים למעלה עם 10 נגדי KΩ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. הגדרת ניסוי ההרגלה
3. ניתוח סרטון הניסוי
איור 5: סטנטור מתכווץ לאחר קבלת גירוי מכני . (A) הסטנטור נמצאים במצבם המוארך ומעוגנים לתחתית לוח פטרי. (B) הסטנטור התכווץ לאחר שקיבל גירוי מכני ברמה 4 ממכשיר ההרגלה. התמונות צולמו במיקרוסקופ USB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
סרטון 1: סרטון של התכווצות סטנטור. הסטנטור מקבלים גירוי מכני ברמה 4 ממכשיר ההרגלה בכל דקה. תאים אלה עדיין לא התרגלו, ולכן הם מתכווצים לאחר קבלת הדופק. התאים נמצאים בצלחת פטרי הממוקמת על גבי מכשיר ההרגלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
השיטה שתוארה לעיל, תוך שימוש בפולס המכני ברמה 4 בתדירות של הקשה אחת לדקה, אמורה לגרום להפחתה הדרגתית בהסתברות ההתכווצות של הסטנטור תוך שעה. זה מעיד על הרגלה ( ראו איור 6, וידאו 2).
איור 6: הרגל בסיסית. הסתברות ההתכווצות של סטנטור יורדת בהדרגה במשך שעה לאחר קבלת פולסים מכניים ברמה 4 בתדירות של 1 ברז/דקה (n = 22-27). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו 2. וידאו של סטנטור רגיל. התאים מקבלים גירוי מכני ברמה 4 לאחר שעה אחת של קבלת פולסים מכניים באותו כוח בתדר של 1 הקשה לדקה. רוב התאים התרגלו לגירויים במהלך השעה, ולכן אינם מתכווצים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
שינוי הכוח ו/או התדירות של העברת הפולס המכני יכול לשנות את דינמיקת ההרגלה של סטנטור . לדוגמה, שימוש בפעימה ברמה 2 בתדירות של הקשה אחת לדקה מונע הרגלה במשך שעה אחת ( ראו איור 7). פולס רמה 5 אמור לעורר התכווצויות אצל מעטים עד אפס סטנטור.
איור 7: חוסר התרגלות תוך שעה אחת לכוחות חזקים יותר. הסתברות ההתכווצות של סטנטור אינה יורדת באופן ניכר במשך שעה אחת לאחר קבלת פולסים מכניים ברמה 2 בתדירות של 1 ברז/דקה (n = 7-33). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול מתייחסים להבטיח כי Stentor להישאר בתנאים אופטימליים עבור התכווצויות להתרחש. תגובת הכיווץ במבחן ההרגלה דורשת שהסטנטורים יהיו מעוגנים למשטח באמצעות האחיזה הדביקה שלהם מכיוון שהם כמעט ולא מתכווצים כשהם שוחים בחופשיות. עם זאת, המשטח התחתון של צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המשמשת לניסויים בהרגלה אינו תורם בדרך כלל לעיגון אלא אם כן הוא מצופה בפולי-אורניתין. יתר על כן, לא ניתן לחשוף את הסטנטור להפרעה מכנית כלשהי למשך שעתיים לפחות לפני תחילת ניסוי ההרגלה מכיוון שציר הזמן של השכחה של סטנטור הוא 2-6 שעות3. אם סטנטור יקבל גירוי מכני תוך שעתיים משעת ההתחלה של ניסוי ההרגלה, קיימת אפשרות שגירוי מוקדם זה יגרום לרמה קלה של הרגלה לפני הניסוי, ובכך יפחית את הסתברות ההתכווצות לאחר שמכשיר ההרגלה יספק את הפולס המכני הראשון. לבסוף, בשלב הניתוח, חשוב לספור רק את מספר הסטנטור המתכווץ לאחר הדופק - ולא התכווצויות ספונטניות מקריות המתרחשות לפני מסירת הדופק - כדי לקבל קריאה מדויקת של חלק התאים שהתכווץ בתגובה לגירוי המכני.
ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לחקור סוגים שונים של דינמיקת הרגלה על ידי שינוי הכוח והתדירות של הפולסים המכניים המועברים על ידי מכשיר ההרגלה. זה גם מספק הזדמנות לחקור סוגים אחרים של למידה, כגון רגישות, שעשויים להתרחש ב - Stentor. ניתן גם להתאים את קוד התוכנית של לוח המיקרו-בקר עצמו כדי לספק תבניות שונות של ברזים מכניים ל-Stentor.
בעיה פוטנציאלית אחת לפתרון בעיות בפרוטוקול זה היא התדירות הנמוכה של עיגון סטנטור , מה שעלול להגביל את מספר הסטנטור שניתן לראות בניסוי ההרגלה. תדירות העיגון מופחתת לעיתים בתרביות סטנטור שלא הוזנו לאחרונה או מזוהמות. כדי לטפל בבעיה זו, יש לשטוף אצווה חדשה של סטנטור כדי להתחיל תרבות חדשה ולהאכיל אותם באופן קבוע על פי הפרוטוקול המתואר ב Lin et al.10.
פרוטוקול זה מוגבל בכך שניתן לבדוק רק צלחת אחת של סטנטור בכל פעם, וכתוצאה מכך מדידות תפוקה נמוכות יחסית. יתר על כן, התוכנה הנוכחית אינה מאפשרת אוטומציה של ניתוח תמונה של תא בודד. רוב הנתונים הנרכשים הם, אם כן, ברמת האוכלוסייה. מודלים עתידיים של מכשיר ההרגלה וכלי ניתוח תמונה עשויים להקל על ניסויים חד-תאיים בעלי תפוקה גבוהה.
ההרגלה בסטנטור נחקרה בעבר בשיטות שתוארו על ידי Wood3, אך פרוטוקול חדש זה מאפשר להפוך את הניסויים לאוטומטיים. אוטומציה לא רק מאפשרת לחוקר לספק פולסים מכניים של כוח ותדר מוגדרים, אלא גם מאפשרת ניסויי הרגלה ארוכי טווח מכיוון שניתן להשאיר את המכשיר פועל ללא פיקוח במשך ימים. יתר על כן, שימוש במנוע צעד ולא בסולנואיד המשמש בניסויים של ווד3 מפחית את הסיכון לדמגנטיזציה לאורך זמן וגם מאפשר לגוון את עוצמת הגירוי במהלך ניסוי יחיד.
חקר הרגלי התאים עשוי לחשוף תובנות קליניות לגבי מצבים כמו הפרעת קשב וריכוז (ADHD) ותסמונת טורט שבה ההרגלה נפגעת11. מנגנוני הרגלת סטנטור עשויים גם לחשוף פרדיגמות למידה לא-סינפטיות חדשות, ללא תלות במעגלים תאיים מורכבים. לבסוף, תובנות על למידה חד-תאית עשויות להוות השראה לשיטות לתכנות מחדש של תאים בתוך רקמות רב-תאיות - אפיק פוטנציאלי נוסף להילחם במחלות.
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים לטטיאנה מקושוק על אינספור דיונים על למידת סטנטור . עבודה זו מומנה על ידי מענק NSF MCB- 2012647 ועל ידי מענק NIH R35 GM130327, כמו גם על ידי פרס I2CELL מקרן פורמנטין-גילברט.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved