Estudando a Habituação em Stentor coeruleus

Resumo

Introduzimos um método para quantificar a habituação do Stentor usando um aparelho ligado à placa do microcontrolador que pode fornecer pulsos mecânicos a uma força e frequência especificadas. Também incluímos métodos para montar o aparelho e configurar o experimento de uma forma que minimize as perturbações externas.

Resumo

A aprendizagem é geralmente associada a um sistema nervoso complexo, mas há evidências crescentes de que a vida em todos os níveis, até células individuais, pode exibir comportamentos inteligentes. Em sistemas naturais e artificiais, a aprendizagem é a atualização adaptativa dos parâmetros do sistema com base em novas informações, e a inteligência é uma medida do processo computacional que facilita a aprendizagem. Stentor coeruleus é um organismo unicelular que habita uma lagoa que exibe habituação, uma forma de aprendizagem na qual uma resposta comportamental diminui após um estímulo repetido. O stentor se contrai em resposta à estimulação mecânica, que é uma aparente resposta de fuga de predadores aquáticos. No entanto, repetidas perturbações de baixa força induzem a habituação, demonstrada por uma redução progressiva na probabilidade de contração. Aqui, apresentamos um método para quantificar a habituação do Stentor usando um aparelho ligado à placa do microcontrolador que pode fornecer pulsos mecânicos a uma força e frequência especificadas, incluindo métodos para construir o aparelho e configurar o experimento de uma maneira que minimize as perturbações externas. Em contraste com as abordagens descritas anteriormente para estimular mecanicamente o Stentor, este dispositivo permite que a força de estimulação seja variada sob controle do computador durante o curso de um único experimento, aumentando assim muito a variedade de sequências de entrada que podem ser aplicadas. Compreender a habituação ao nível de uma única célula ajudará a caracterizar paradigmas de aprendizagem que são independentes de circuitos complexos.

Introdução

A aprendizagem é geralmente associada a um sistema nervoso complexo, mas há evidências crescentes de que a vida em todos os níveis, até células individuais, pode exibir comportamentos inteligentes. Em sistemas naturais e artificiais, a aprendizagem é a atualização adaptativa dos parâmetros do sistema com base em novas informações¹, e a inteligência é uma medida do processo computacional que facilita a aprendizagem².

O stentor coeruleus é um organismo unicelular que habita a lagoa que apresenta habituação, uma forma de aprendizagem na qual uma resposta comportamental diminui após um estímulo repetido³. O stentor se contrai em resposta à estimulação mecânica³, que é uma aparente resposta de fuga de predadores aquáticos. No entanto, repetidas perturbações de baixa força induzem a habituação, demonstrada por uma redução progressiva na probabilidade de contração³. O Stentor habituado ainda se contrai após receber estimulação mecânica de alta força⁴ ou estimulação fótica⁵. Essas observações, que se alinham com os critérios clássicos de Thompson e Spencer para habituação em animais⁶, sugerem fortemente que o decréscimo da resposta contrátil original é devido à aprendizagem, e não à fadiga ou ao esgotamento do ATP. Como uma célula de vida livre, o Stentor pode ser estudado sem muita interferência das células circundantes, como seria o caso em um tecido multicelular. Várias características adicionais fazem do Stentor um sistema tratável para estudar a aprendizagem: seu grande tamanho (1 mm), sua resposta de habituação quantificável³, a facilidade de injeção e micromanipulação⁷, o genoma totalmente sequenciado⁸ e a disponibilidade de ferramentas de interferência de RNA (RNAi)⁹. Usando este organismo modelo para explorar a aprendizagem celular sem um cérebro ou sistema nervoso requer um procedimento reprodutível para estimular as células Stentor e medir a resposta.

Aqui, apresentamos um método para quantificar a habituação do Stentor usando um aparelho ligado à placa do microcontrolador que pode fornecer pulsos mecânicos a uma força e frequência especificadas, incluindo métodos para construir o aparelho e configurar o experimento de uma forma que minimize as perturbações externas (Figura 1). Compreender a habituação ao nível de uma única célula ajudará a caracterizar paradigmas de aprendizagem que são independentes de circuitos complexos.

Figura 1: Configuração do experimento de habituação. A placa de Petri contendo Stentor é colocada sobre a régua de metal flexível do dispositivo de habituação. A armadura do dispositivo de habituação então atinge a régua de metal em uma força e frequência especificadas, produzindo uma onda de estímulo em todo o campo das células. A câmera do microscópio USB registra as respostas do Stentor à estimulação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resumo do fluxo de trabalho do experimento de habituação. A figura mostra as etapas básicas envolvidas no estudo do Stentor usando o dispositivo de habituação. A figura foi criada com BioRender.com. Adaptado de "Fluxograma de Processo", de BioRender.com (2022). Recuperado de https://app.biorender.com/biorender-templates. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

NOTA: Um resumo do fluxo de trabalho do experimento de habituação é mostrado na Figura 2.

1. Montagem do dispositivo de habituação

1. Conecte o driver do motor ao motor (consulte a Figura 3).
   1. Conecte os dois fios rotulados A da placa do motorista aos fios azuis e vermelhos do motor. Conecte os dois fios rotulados B da placa do motorista aos fios verde e preto do motor.
      NOTA: Olhando para baixo na placa do motorista de cima com os fios do motor na parte superior, os quatro fios de entrada devem se conectar aos cabos do motor nesta ordem: azul, vermelho, preto e verde.
2. Construa o circuito da breadboard mostrado na Figura 4, com especial cuidado para conectar os LEDs na polaridade correta.
3. Conecte o Vcc (+5 V) da placa do motorista ao trilho superior do breadboard branco e o Gnd do quadro do motorista ao trilho inferior do breadboard.
4. Conecte o solo da placa de pão ao pino de aterramento da placa microcontroladora. Conecte os fios de LED verde, LED vermelho, interruptor e botão, respectivamente, aos pinos digitais da placa microcontroladora 8, 9, 10 e 11.
5. Conecte os pinos digitais 2 e 3 da placa do microcontrolador aos fios da placa do driver Step e Dir.
6. Conecte os pinos digitais 4, 5, 6 e 7 da placa do microcontrolador aos fios da placa do driver.
   1. Conecte o Pin 4 ao MS1, conecte o Pin 5 ao MS2, conecte o Pin 6 ao MS3 e conecte o Pin 7 ao Enable.
7. Ligue a placa do driver com uma fonte de alimentação de 12 V. Ligue a alimentação de 12 V à ficha do adaptador preto/verde ligada por dois fios vermelhos à placa do condutor do motor.
   NOTA: Não ligue a fonte de alimentação de 12 V à ficha da placa microcontroladora.
8. Baixe o programa de controle (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) na placa microcontroladora.
9. Use um cabo USB para conectar a placa microcontroladora a um computador, que também servirá como fonte de alimentação para a placa microcontroladora.
10. Verifique se os controles de usuário estão funcionando.
    1. Confirme se o interruptor deslizante ativa e desativa o modo automático. No modo automático, o sistema dará um passo em intervalos regulares especificados pelo usuário (veja abaixo).
    2. Verifique se o LED verde acende quando o modo automático está aceso.
    3. Verifique se o LED vermelho pisca 1 s antes que o motor aplique um pulso. O LED vermelho é uma luz de aviso que indica quando o sistema está prestes a fornecer um pulso mecânico.
    4. Teste o botão vermelho, que aciona um passo micro de 1/16 toda vez que o botão é pressionado, independentemente de o sistema estar no modo automático.

Figura 3: Componentes do dispositivo de habituação. Todos os componentes eletrônicos rotulados são necessários para montar a máquina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Esquema eletrônico. Este é o circuito na breadboard. Os fios que se conectam à placa microcontroladora são numerados conforme descrito no protocolo. D1 e D2 são os LEDs vermelhos e verdes, respectivamente, e são conectados ao solo através de 330 resistores Ω. Os dois interruptores são puxados para cima com resistores de 10 KΩ. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Configurando o experimento de habituação

1. Obtenha o Stentor.
2. Revestir uma placa de 35 mm com solução de poli-ornitina a 0,01%.
   1. Adicionar 3 ml da solução de poli-ornitina a 0,01% à placa e deixar durante a noite.
   2. Lave a placa duas vezes com água ultrapura e uma vez com água de nascente pasteurizada (PSW) (Tabela de Materiais).
3. Adicionar 3,5 mL de PSW à placa de 35 mm.
4. Lave o Stentor em uma placa de 6 poços (Tabela de Materiais).
   1. Adicione 3 mL de PSW ao primeiro poço e 5 mL de PSW ao segundo e terceiro poços. Use uma pipeta P1.000 para adicionar 2 mL de Stentor de um prato de cultura ao primeiro poço da placa de 6 poços.
   2. Identifique o Stentor individual com um microscópio estéreo (Tabela de Materiais) e, em seguida, use uma pipeta P20 para transferir 100 Stentor do primeiro poço para o segundo poço.
   3. Identifique o Stentor individual com um microscópio estéreo e, em seguida, use uma pipeta P20 para transferir 100 Stentor do segundo poço para o terceiro poço.
5. Use uma pipeta P200 para transferir 100 Stentor em um volume total de 500 μL do terceiro poço da placa de 6 poços para a placa de 35 mm, de modo que o volume final na placa de 35 mm seja de 4 mL.
6. Cole um pedaço (7 cm x 7 cm) de papel branco à régua de metal no dispositivo de habituação. Certifique-se de que a borda esquerda do papel esteja a 2 cm da extremidade da régua mais próxima da armadura.
7. Use fita dupla face para aderir a parte inferior da placa de 35 mm ao centro do 2 em x 2 em papel no topo da régua no dispositivo de habituação.
8. Deixe a placa de 35 mm no dispositivo de habituação por pelo menos 2 h (isso pode ser estendido para a noite) com a tampa fechada. Durante todo esse período de aclimatação, mantenha a placa em condições de luz ambiente que correspondam às condições experimentais de luz (ou seja, não submeta as células a flutuações de luz / escuridão). Além disso, certifique-se de que a placa não sofra perturbações mecânicas de empurrões acidentais.
9. Centralize a câmera do microscópio USB (Tabela de Materiais) diretamente acima da placa de 35 mm do Stentor. Se necessário, coloque um suporte como uma caixa de ponta de pipeta sob a câmera de microscópio USB (barramento serial universal) para ajustar a altura. Alternativamente, um suporte de anel pode ser usado para ajustar a altura.
10. Instale o aplicativo gravador de webcam em um laptop (Tabela de Materiais) e use-o para visualizar as células através da entrada do microscópio.
    1. Abra o aplicativo Gravador de webcam e selecione o microscópio USB no menu suspenso. Ajuste o foco na câmera do microscópio USB para que as células estejam claramente à vista.
    2. Ajuste a posição da câmera do microscópio USB para maximizar o número de células no campo de visão.
11. Abra o monitor serial da placa microcontroladora: selecione Sem Fim de Linha e defina-o como 9.600 baud.
12. Use o comando l no programa da placa microcontroladora para abaixar a armadura até que ela mal toque na régua. Use o comando r para levantar o braço, se necessário, para ajustar a posição exata.
    NOTA: Se a armadura estiver a uma distância significativa da régua, digite o comando d para desativar a corrente da bobina do motor para que o braço possa ser movido manualmente em direção à régua. Depois de mover o braço manualmente, use o comando e para ativar a corrente da bobina do motor e manter o braço travado na posição. Quando devidamente abaixada antes do início de um experimento, a ponta inferior da armadura deve estar a 1 cm de distância da borda esquerda da régua. A armadura fornecerá o pulso mecânico batendo na régua.
13. Use o comando i para inicializar o modo automático no dispositivo de habituação.
14. Insira o tamanho da etapa na linha de comando. O nível 5 é o menor passo e o nível 1 é o maior passo. O nível 4 é o tamanho do passo usado para experimentos de habituação de linha de base.
    NOTA: Um estímulo de Nível 5 resulta em um deslocamento para baixo da régua em ~0,5 mm; O nível 4 resulta em deslocamento descendente de ~1 mm; O nível 3 resulta em deslocamento descendente de ~2 mm; O nível 2 resulta em deslocamento descendente de ~3-4 mm; e o Nível 1 resulta em deslocamento descendente de ~8 mm. Um estímulo de Nível 5 resulta em uma força de pico descendente da armadura contra a régua de ~0,122 N; O nível 4 resulta em uma força de pico descendente de ~0,288 N; e o Nível 3 resulta em uma força de pico descendente de ~0,557 N. As forças descendentes geradas pelo Nível 1 e Nível 2 são mais difíceis de quantificar empiricamente com um dinamômetro devido às oscilações significativas da régua que ocorrem após o contato da armadura.
15. Insira o tempo entre pulsos em minutos. O intervalo usado para experimentos de habituação basal é de 1 min.
16. Comece a gravar um vídeo usando o aplicativo Gravador de webcam pressionando o botão vermelho de gravação. Em seguida, ligue o interruptor no aparelho de habituação para iniciar o experimento com a primeira entrega automatizada de pulsos mecânicos.

3. Analisando o vídeo do experimento

1. Imediatamente antes que o primeiro pulso mecânico apareça no vídeo, pause e conte o número de Stentor que estão ancorados na parte inferior da placa de 35 mm e estendidos em uma forma alongada semelhante a uma trombeta (Figura 5A, Vídeo 1).
2. Imediatamente após o primeiro pulso, conte o número de Stentor que estão ancorados no fundo da placa e contraídos em uma forma de bola (Figura 5B, Vídeo 1).
   NOTA: As células contraídas são facilmente discerníveis a partir de células alongadas porque o Stentor encurta o comprimento do seu corpo em mais de 50% dentro de 10 ms durante um evento de contração³.
3. Divida a segunda contagem pela primeira contagem para determinar a fração de Stentor que se contraiu em resposta ao estímulo mecânico.
4. Repita as etapas 3.1-3.3 para todos os pulsos mecânicos no vídeo do experimento.

Figura 5: Stentor se contraindo após receber um estímulo mecânico. (A) Os Stentor estão em seu estado alongado e ancorados no fundo da placa de Petri. (B) O Stentor contraiu-se depois de receber uma estimulação mecânica de Nível 4 do dispositivo de habituação. As imagens foram obtidas com microscópio USB. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo da contratação do Stentor. O Stentor recebe um estímulo mecânico de Nível 4 do dispositivo de habituação a cada minuto. Essas células ainda não se habituaram, então elas se contraem depois de receber o pulso. As células estão na placa de Petri colocada sobre o dispositivo de habituação. Clique aqui para baixar este vídeo.

Resultados

O método descrito acima, utilizando o pulso mecânico de Nível 4 a uma frequência de 1 toque/min, deve resultar em uma redução progressiva na probabilidade de contração do Stentor dentro de 1 h. Isso é indicativo de habituação (ver Figura 6, Vídeo 2).

Figura 6: Habituação basal. A probabilidade de contração do Stentor diminui progressivamente ao longo de 1 h após receber pulsos mecânicos de Nível 4 a uma frequência de 1 toque/min (n = 22-27). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 2. Vídeo de Stentor habituado. As células recebem um estímulo mecânico de Nível 4 após 1 h de receber pulsos mecânicos da mesma força a uma frequência de 1 toque/min. A maioria das células habituou-se aos estímulos durante a hora e, portanto, não se contraem. Clique aqui para baixar este vídeo.

Alterar a força e/ou a frequência da entrega do pulso mecânico pode alterar a dinâmica de habituação do Stentor . Por exemplo, o uso do pulso de nível 2 a uma frequência de 1 toque/min impede a habituação ao longo de 1 h (ver Figura 7). Um pulso de nível 5 deve provocar contrações em poucos a zero Stentor.

Figura 7: Falta de habituação dentro de 1 h para forças mais fortes. A probabilidade de contração do Stentor não diminui sensivelmente ao longo de 1 h após receber pulsos mecânicos de Nível 2 a uma frequência de 1 toque/min (n = 7-33). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

As etapas mais críticas do protocolo estão relacionadas a garantir que o Stentor permaneça em condições ideais para que as contrações ocorram. A resposta de contração no ensaio de habituação requer que os Stentors estejam ancorados a uma superfície usando seu pegajoso holdfast, uma vez que raramente se contraem quando estão nadando livremente. No entanto, a superfície inferior da placa de Petri de 35 mm usada para experimentos de habituação não é tipicamente propícia para ancoragem, a menos que seja revestida com poli-ornitina. Além disso, o Stentor não pode ser exposto a qualquer perturbação mecânica por um período mínimo de 2 h antes do início do experimento de habituação porque a escala de tempo de esquecimento do Stentor é de 2-6 h³. Se o Stentor receber estimulação mecânica dentro de 2 h da hora de início do experimento de habituação, existe a possibilidade de que essa estimulação prévia induza um leve nível de habituação antes do experimento, reduzindo assim a probabilidade de contração após o dispositivo de habituação fornecer o primeiro pulso mecânico. Finalmente, durante a fase de análise, é importante contar apenas o número de Stentor que se contraem após um pulso - em vez de quaisquer contrações espontâneas incidentais que ocorram antes da entrega do pulso - para obter uma leitura precisa da fração de células que se contraíram em resposta à estimulação mecânica.

O protocolo pode ser prontamente modificado para estudar diferentes tipos de dinâmica de habituação, alterando a força e a frequência dos pulsos mecânicos entregues pelo dispositivo de habituação. Isso também oferece uma oportunidade para explorar outros tipos de aprendizagem, como a sensibilização, que podem ocorrer no Stentor. O próprio código do programa da placa microcontroladora também pode ser ajustado para fornecer diferentes padrões de torneiras mecânicas ao Stentor.

Um problema potencial para solucionar com esse protocolo é a baixa frequência de ancoragem do Stentor, o que poderia restringir o número de Stentor que pode ser observado no experimento de habituação. A frequência de ancoragem é por vezes reduzida em culturas de Stentor que não foram recentemente alimentadas ou estão contaminadas. Para resolver esse problema, deve-se lavar um novo lote de Stentor para iniciar uma nova cultura e alimentá-los regularmente de acordo com o protocolo descrito em Lin et ^al.10.

Este protocolo é limitado na medida em que apenas uma única placa de Stentor pode ser testada de cada vez, resultando em medições de rendimento relativamente baixo. Além disso, o software atual não permite a automação da análise de imagens de célula única. A maioria dos dados adquiridos está, portanto, em nível populacional. Modelos futuros do dispositivo de habituação e ferramentas de análise de imagem podem facilitar experimentos de célula única de alto rendimento.

A habituação em Stentor foi previamente estudada usando métodos descritos por Wood³, mas este novo protocolo permite que os experimentos sejam automatizados. A automação não só permite que o pesquisador forneça pulsos mecânicos de força e frequência reprodutíveis, mas também facilita experimentos de habituação a longo prazo, uma vez que o dispositivo pode ser deixado funcionando sem supervisão por dias. Além disso, o uso de um motor de passo em vez do solenoide empregado nos experimentos de Wood³ reduz o risco de desmagnetização ao longo do tempo e também permite que a força do estímulo seja variada durante o curso de um único experimento.

O estudo da habituação celular pode revelar insights clínicos para condições como o transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (TDAH) e a síndrome de Tourette, na qual a habituação é prejudicada¹¹. Os mecanismos de habituação do stentor também podem revelar novos paradigmas de aprendizagem não sinápticos independentes de circuitos celulares complexos. Finalmente, insights sobre o aprendizado de células únicas poderiam inspirar métodos para reprogramar células dentro de tecidos multicelulares - outro caminho potencial para combater doenças.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% Poly-ornithine	Millipore Sigma	P4957	Used to coat Petri plate
35-mm Petri plate	Benz Microscope Optics Center Inc.	L331	Contains Stentor during experiments
6-well plate	StemCell Technologies	38016	Used to wash Stentor
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1)	Thorlabs	MB424	Used to construct habituation device
Big easy driver stepper motor driver board (x1)	Sparkfun	ROB-12859	Used to construct habituation device
Construction rail, 1" x 5'' (x2)	Newport	Newport CR-1	Used to construct habituation device
Laptop	Apple Store	https://www.apple.com/macbook-air-m1/	Connect laptop to USB microscope to visualize experiments
Large right-angle bracket (x1)	Thorlabs	AP90RL	Used to construct habituation device
Microcontroller board	Arduino	A000066	Used to control habituation device
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead	Stepperonline.com	5-17HS19-2004S1	Used to construct habituation device
Pasteurized spring water	Carolina	132458	Media for Stentor experiments
Right-angle bracket (x3)	Thorlabs	AP90	Used to construct habituation device
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss		Used to visualize Stentor during wash steps
Stentor coeruleus	Carolina	131598	These are the cells used for habituation experiments
USB microscope	Celestron	44308	Used to visualize and record experiments
Webcam recorder	Apple Store	https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12	Install this application to take videos of experiments