מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

Abstract

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) עם יכולת אינסופית של התרבות עצמית צפויים להיות בעלי יישומים בתחומים רבים, כולל הבהרה של פתולוגיות של מחלות נדירות, פיתוח תרופות חדשות ורפואה רגנרטיבית שמטרתה לשקם איברים פגועים. למרות זאת, היישום החברתי של hiPSCs עדיין מוגבל. זאת, בין היתר, בשל הקושי לשחזר את הבידול בתרבות, אפילו עם ידע מתקדם וכישורים טכניים מתוחכמים, בשל הרגישות הגבוהה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לשינויים סביבתיים זעירים. היישום של מערכת תרבות אוטומטית יכול לפתור בעיה זו. ניתן לצפות לניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה שאינה תלויה במיומנותו של החוקר על פי נוהל משותף בין מכונים שונים. למרות שמספר מערכות תרבות אוטומטיות המסוגלות לשמור על תרביות iPSC ולגרום לבידול פותחו בעבר, מערכות אלה הן כבדות, גדולות ויקרות מכיוון שהן עושות שימוש בזרועות רובוטיות אנושיות ורב-מפרקיות. כדי לשפר את הבעיות הנ"ל, פיתחנו מערכת חדשה באמצעות מערכת פשוטה של מסילות הזזה על ציר x-y-z, המאפשרת לה להיות קומפקטית יותר, קלה יותר וזולה יותר. יתר על כן, המשתמש יכול בקלות לשנות פרמטרים במערכת החדשה כדי לפתח משימות טיפול חדשות. לאחר קביעת משימה, כל שעל המשתמש לעשות הוא להכין את ה- iPSC, לספק מראש את הריאגנטים והחומרים המתכלים הדרושים למשימה הרצויה, לבחור את מספר המשימה ולציין את השעה. אישרנו כי המערכת יכולה לשמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במצב בלתי ממוין באמצעות מספר מעברים ללא תאי הזנה ולהתמיין לסוגי תאים שונים, כולל קרדיומיוציטים, הפטוציטים, אבות עצביים וקרטינוציטים. המערכת תאפשר ניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה בין מוסדות ללא צורך בחוקרים מיומנים ותקל על יישום חברתי של hiPSCs במגוון רחב יותר של תחומי מחקר על ידי הפחתת המכשולים לערכים חדשים.

Introduction

מאמר זה נועד לספק נהלי טיפול בפועל ומפורטים עבור מערכת תרבית אוטומטית עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC), אשר ייצרנו על ידי שיתוף פעולה עם חברה, ולהציג תוצאות מייצגות.

מאז פרסום המאמר בשנת 2007, iPSC מושך תשומת לב בכל רחבי העולם¹. בשל התכונה הגדולה ביותר של היכולת להתמיין לכל סוג של תא סומטי, הוא צפוי להיות מיושם בתחומים שונים כגון רפואה רגנרטיבית, להבהיר את הגורמים למחלות עקשניות, ופיתוח תרופות טיפוליות חדשות ^2,3. בנוסף, שימוש בתאים סומטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבני אדם עשוי להפחית ניסויים בבעלי חיים, הכפופים למגבלות אתיות משמעותיות. למרות שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הומוגניים רבים נדרשים כל הזמן לחקור שיטות חדשות עם iPSCs, זה מייגע מדי לנהל אותם. יתר על כן, הטיפול ב- iPSC קשה בגלל רגישותו הגבוהה, אפילו לשינויים תרבותיים וסביבתיים עדינים.

כדי לפתור בעיה זו, מערכות תרבות אוטומטיות צפויות לבצע משימות במקום בני אדם. קבוצות מסוימות פיתחו כמה מערכות אוטומטיות לתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיות אנושיות לתחזוקה והתמיינות של תאים ופרסמו את הישגיהן ^4,5,6. מערכות אלה מציידות זרועות רובוטיות רב-מפרקיות. לזרועות רובוטיות יש לא רק ערך בכך שהן מחקות מאוד תנועות זרוע אנושיות, אלא גם ראויות בכך שהן דורשות עלויות גבוהות יותר עבור הזרוע(ות), אריזות מערכת גדולות וכבדות יותר, ומאמצי חינוך גוזלי זמן על ידי המהנדסים כדי להשיג את התנועות המכוונות ^7,8. על מנת להקל על החדרת המנגנון למתקני מחקר נוספים בנקודות של צריכת משאבים כלכליים, חלל ומשאבי אנוש, פיתחנו מערכת תרבית אוטומטית חדשנית לתחזוקה והתמיינות של iPSC לסוגי תאים שונים⁹.

הרציונל שלנו למערכת החדשה היה לאמץ מערכת מסילות ציר X-Y-Z במקום זרועות רובוטיות רב-מפרקיות⁹. כדי להחליף את הפונקציות המורכבות דמויות היד של זרועות רובוטיות, יישמנו רעיון חדש למערכת זו, אשר יכול לשנות באופן אוטומטי שלושה סוגים של קצוות זרוע פונקציונליים ספציפיים. כאן, אנו גם מציינים כיצד משתמשים יכולים בקלות לבצע לוחות זמנים של משימות עם הזמנות פשוטות בתוכנה בגלל היעדר דרישות לתרומות המהנדסים לאורך כל התהליך.

אחת ממערכות התרבית הרובוטיות הדגימה יצירת גופים עובריים באמצעות לוחות 96 בארות כצברי תאים תלת-ממדיים להתמיינות⁴. המערכת המדווחת כאן אינה יכולה להתמודד עם לוחות 96 בארות. אחד מהם השיג את הציון הנוכחי של תנאי ייצור נאותים (cGMP) באמצעות קו תאים, למרות שזה לא היה תא גזע פלוריפוטנטי אנושי⁵. מערכת התרביות האוטומטיות המפורטת כאן פותחה כעת במטרה ספציפית לסייע בניסויי מעבדה (איור 1). עם זאת, יש לו מספיק מערכות כדי לשמור על רמות נקיות שוות ערך לארון בטיחות ברמה IV.

Protocol

ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של קנסאי אישרה את הייצור והשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים בריאים שמקורם במתנדבים בשם KMUR001 (אישור מס' 2020197). התורם, שגויס בגלוי, סיפק הסכמה רשמית מדעת והסכים לשימוש המדעי בתאים.

הערה: הממשק הנוכחי (התוכנה המיוחדת בשם "ccssHMI" הפועלת תחת מערכת ההפעלה Windows XP) הוא מסך הפעולה הבסיסי. תחת הממשק הנ"ל, סדרה של כרטיסיות מסודרות, המאפשר למשתמשים ליזום פעולות שונות.

1. פעולות טעינה

1. לחץ על טען כפתור במסך העליון של התוכנה. לחץ על הלחצן Loading Preparation Start .
2. הניחו את הצלחות או הצלחות שיוכנסו למכשיר במקומן במנגנון.
   הערה: המידע הדרוש לזיהוי צלחת צריך להיות כתוב על כל מכסה.
3. סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
4. בחר את הסוג והכמות של הצלחות או הצלחות בתוכנה.
5. לחץ על הלחצן טען הכנה הושלמה . לחץ על לחצן 'טען התחל '.
6. לאחר העלאת צלחת למערכת, בחר את המידע על המנה, כגון עם תאי iPS או ללא תאי iPS, בתוכנה. רשום הערות על כל מנה בתוכנה.
7. לחץ על לחצן רישום בסוף כדי להשלים את פעולת הטעינה.

2. פעולת פריקה

1. לחץ על הלחצן Unload במסך העליון של התוכנה. בחר את המנות שברצונך להסיר בתוכנה.
2. לאחר בחירת המנה, לחץ על הלחצן Unloading Preparation Start . לחץ על לחצן התחל פריקה .
3. לאחר העברת הצלחות מהאינקובטור לשולחן העבודה במערכת, יש ללחוץ על כפתור הסרת הכלים .
4. פתחו ידנית את חלון ההזזה הקדמי והוציאו את הכלים. סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.

3. תוספת של חומרים מתכלים: פיפטה, צינורות, בינוני

1. כדי לחדש חומרים מתכלים כגון פיפטה, צינורות ומדיום, לחץ/י על הכפתור ״חומרים מתכלים״ במסך העליון של התוכנה ולאחר מכן בחר/י את הפריט לחידוש.
   1. פיפטות
      1. לחץ על לחצן פיפטה . בחר בלחצן חדש .
      2. בחר ארון תקשורת שהמשתמש רוצה לחדש בתוכנה. לחץ על הלחצן Relenish Start .
      3. לאחר אישור כי המכסה של אזור אחסון פיפטה על שולחן העבודה נפתח, לפתוח ידנית את חלון הזזה הקדמי ולחדש את פיפטות לפי הצורך.
      4. סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני. לחץ על הלחצן חדש הושלם .
      5. לחץ/י על הכפתור ״ הגדרת חידוש ״ והזן/י את פרטי החידוש ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״רישום ״.
      6. לחץ על הלחצן חדש הושלם .
   2. צינורות
      1. לחץ על הלחצן Tube . בחר בלחצן חדש .
      2. בחר ארון תקשורת שהמשתמש רוצה לחדש בתוכנה. לחץ על הלחצן Relenish Start .
      3. לאחר אישור שהמדף עבר לחלק העליון, לחץ על הלחצן חדש צינור .
      4. פתח ידנית את חלון ההזזה הקדמי וחדש את הצינורות לפי הצורך.
      5. סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
      6. לחץ על הלחצן חדש הושלם .
      7. לחץ/י על הכפתור ״ הגדרת חידוש ״ והזן/י את פרטי החידוש ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״רישום ״. לחץ על לחצן סגור .
   3. בינוני
      1. לחץ על הלחצן בינוני . בחר בלחצן חדש בתוכנה.
      2. בחר ארון תקשורת אחד מתוך שלושה שהמשתמשים רוצים לחדש. לחץ על הלחצן Relenish Start .
      3. לאחר אישור כי המכסה של אזור האחסון הבינוני נפתח, פתח ידנית את חלון ההזזה הקדמי וחדש את המדיום.
      4. סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
      5. לחץ על הלחצן חדש הושלם .
      6. לחץ על הלחצן חדש והזן את המידע עבור המדיום, כולל השם והכמות של המדיום. הזן הערות נוספות במידת הצורך.
      7. לחץ על הלחצן הרשמה .
      8. לחץ על לחצן סגור .

4. בחירת משימות

1. לחץ על לחצן משימה במסך העליון של התוכנה.
2. בחר בלחצן הגדרת משימה . בחר את המשימה הרצויה מרשימת המשימות ולחץ על הלחצן השלב הבא .
3. ציין את התאריך והשעה לביצוע המשימה ולאחר מכן לחץ על הלחצן הרשמה . בחר צלחת או צלחת לביצוע המשימה ולאחר מכן לחץ על לחצן הרשמה .
4. לאחר אישור מחדש של המשימה שנבחרה, לחץ על לחצן הרשמה . ודא שהמשימה נרשמה במסך הבא.
5. במידת הצורך, הגדר את המשימה הבאה באותו אופן.
6. לחץ על לחצן התחל בסוף. לאחר מכן, המשימה תתחיל באופן אוטומטי בתאריך ובשעה שצוינו.
   הערה: מיד לאחר סיום כל משימה, אורות UV (הממוקמים משני צידי מכסה המנוע) נדלקים באופן אוטומטי, ולאחר 5-30 דקות, בהתאם להגדרת העזר, הם כבויים כדי לשמור על מכסה המנוע במצב אספטי. כדי לעצור, משתמשים יכולים ללחוץ על לחצן התחל .
7. אם משתמשים רוצים לבטל משימה מתוזמנת מראש, לחץ על לחצן עצור .
8. לאחר בחירת המשימה לביטול, לחץ על לחצן ערוך משימה .
9. לחץ על לחצן ביטול משימה . אשר שהמשימה נמחקה במסך הבא.

5. בדוק תמונות סלולריות

1. כל משימה כוללת תצפיות מיקרוסקופיות (צילום) לפני ואחרי עבודת המשימה. התבונן בהתקדמות תרבית התאים באופן צילומי על ידי שילוב משימת צילום מיקרוסקופית לפני או אחרי כל משימה.
2. בחר תוכניות משימה מוגדרות מראש, כולל בחירת מיקומים ספציפיים מרובים של הצלחת או צלחת הבאר מראש לתצפית בנקודה קבועה כדי לפקח על אותו מיקום לאורך זמן.

6. מעבר ובידול

1. בצע את השלבים בסעיפים 1-5 והגדר את המערכת האוטומטית לתרביות תאים לביצוע העברה והתמיינות. הגדרות המכשיר למעבר, התמיינות קרדיומיוציטים, התמיינות הפטוציטים, התמיינות תאים קודמנים עצביים והתמיינות קרטינוציטים מוצגות בטבלה 1, טבלה 2, טבלה 3, טבלה 4 וטבלה 5, בהתאמה.

תוצאות

תחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם
השתמשנו בשלושה קווי hPSC (RIKEN-2F, 253G1 ו-KMUR001). ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול התחזוקה באמצעות ניסויים ידניים יומיים ואופטימיזציה נוספת של התוכניות המפורטות באמצעות שבעת הניסויים המקדימים שבוצעו על ידי המערכת. לדוגמה, לחצי גזירה הנג...

Discussion

שלב קריטי בפרוטוקול הוא שאם משתמש מוצא תקלות כלשהן, לחץ על לחצן ביטול, עצירה או איפוס בכל עת והתחל מחדש מהצעד הראשון. התוכנה יכולה למנוע טעויות אנוש, כולל הזמנה כפולה, פתיחת דלתות בזמן שמשימות המערכת פעילות, וחוסר חידוש. נקודה קריטית נוספת להתמיינות מוצלחת ויעילה לתא הסומטי הרצוי היא בחירה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A