Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Zusammenfassung

Es wird erwartet, dass humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) mit unendlicher Selbstproliferationsfähigkeit in zahlreichen Bereichen Anwendung finden, darunter die Aufklärung seltener Krankheiten, die Entwicklung neuer Medikamente und die regenerative Medizin zur Wiederherstellung geschädigter Organe. Trotzdem ist die gesellschaftliche Umsetzung von hiPSCs noch begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass es schwierig ist, die Differenzierung in der Kultur zu reproduzieren, selbst mit fortgeschrittenem Wissen und ausgefeilten technischen Fähigkeiten, was auf die hohe Empfindlichkeit von iPS-Zellen gegenüber winzigen Umweltveränderungen zurückzuführen ist. Die Anwendung eines automatisierten Kultursystems kann dieses Problem lösen. Experimente mit hoher Reproduzierbarkeit, unabhängig von den Fähigkeiten eines Forschers, können nach einem gemeinsamen Verfahren über verschiedene Institute hinweg erwartet werden. Obwohl bereits mehrere automatisierte Kultursysteme entwickelt wurden, die iPSC-Kulturen aufrechterhalten und eine Differenzierung induzieren können, sind diese Systeme schwer, groß und kostspielig, da sie humanisierte, mehrgliedrige Roboterarme verwenden. Um die oben genannten Probleme zu verbessern, haben wir ein neues System entwickelt, das ein einfaches G-Y-Z-Achsen-Gleitschienensystem verwendet, das es kompakter, leichter und kostengünstiger macht. Darüber hinaus kann der Benutzer Parameter im neuen System einfach ändern, um neue Handhabungsaufgaben zu entwickeln. Sobald eine Aufgabe eingerichtet ist, muss der Benutzer nur noch den iPSC vorbereiten, die für die gewünschte Aufgabe benötigten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien im Voraus bereitstellen, die Aufgabennummer auswählen und die Uhrzeit angeben. Wir bestätigten, dass das System iPS-Zellen über mehrere Passagen ohne Feederzellen in einem undifferenzierten Zustand halten und sich in verschiedene Zelltypen differenzieren kann, darunter Kardiomyozyten, Hepatozyten, neurale Vorläuferzellen und Keratinozyten. Das System wird hochgradig reproduzierbare Experimente zwischen Institutionen ermöglichen, ohne dass qualifizierte Forscher erforderlich sind, und es wird die soziale Implementierung von hiPSCs in einem breiteren Spektrum von Forschungsfeldern erleichtern, indem es die Hindernisse für neue Markteintritte verringert.

Einleitung

Dieser Artikel zielt darauf ab, aktuelle und detaillierte Handhabungsverfahren für ein automatisiertes Kultursystem für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), das wir in Zusammenarbeit mit einem Unternehmen hergestellt haben, vorzustellen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen.

Seit der Veröffentlichung des Artikels im Jahr 2007 erregt iPSC weltweit Aufmerksamkeit¹. Aufgrund seiner größten Eigenschaft, sich in jede Art von Körperzellen differenzieren zu können, wird erwartet, dass es in verschiedenen Bereichen wie der regenerativen Medizin, der Aufklärung der Ursachen hartnäckiger Krankheiten und der Entwicklung neuer therapeutischer Medikamente eingesetzt wird ^2,3. Darüber hinaus könnte die Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten somatischen Zellen Tierversuche reduzieren, die erheblichen ethischen Einschränkungen unterliegen. Obwohl ständig zahlreiche homogene iPS-Zellen benötigt werden, um neue Methoden mit iPS-Zellen zu erforschen, ist es zu aufwendig, diese zu verwalten. Darüber hinaus ist die Handhabung von iPSC aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, selbst gegenüber subtilen kulturellen und umweltbedingten Veränderungen, schwierig.

Um dieses Problem zu lösen, wird erwartet, dass automatisierte Kultursysteme anstelle von Menschen Aufgaben übernehmen. Einige Gruppen haben einige automatisierte humane pluripotente Stammzellkultursysteme für die Zellerhaltung und -differenzierung entwickelt und ihre Ergebnisse veröffentlicht ^4,5,6. Diese Systeme sind mit mehrgelenkigen Roboterarmen ausgestattet. Roboterarme haben nicht nur den Vorteil, dass sie die Bewegungen des menschlichen Arms in hohem Maße nachahmen, sondern auch den Vorteil, dass sie höhere Kosten für die Arme, eine größere und schwerere Systemverpackung und zeitaufwändige Schulungsanstrengungen durch die Ingenieure erfordern, um die gezielten Bewegungen zu erhalten ^7,8. Um die Einführung des Apparats in mehr Forschungseinrichtungen an den Punkten des wirtschaftlichen, räumlichen und personellen Verbrauchs zu erleichtern, haben wir ein neuartiges automatisiertes Kultursystem für die Aufrechterhaltung und Differenzierung von iPSC in verschiedene Zelltypen entwickelt⁹.

Unsere Begründung für das neue System war die Verwendung eines X-Y-Z-Achsen-Schienensystems anstelle von Roboterarmen mit mehreren Gelenken⁹. Um die komplexen handähnlichen Funktionen von Roboterarmen zu ersetzen, haben wir eine neue Idee auf dieses System angewendet, das automatisch drei Arten von spezifischen funktionalen Armspitzen wechseln kann. Hier zeigen wir auch, wie Benutzer Aufgabenpläne mit einfachen Aufträgen in der Software erstellen können, da während des gesamten Prozesses keine Anforderungen an die Beiträge der Ingenieure gestellt werden müssen.

Eines der Roboterkultursysteme hat die Herstellung von Embryoidkörpern unter Verwendung von 96-Well-Platten als 3D-Zellaggregate zur Differenzierung demonstriert⁴. Das hier beschriebene System kann keine 96-Well-Platten verarbeiten. Eine davon erreichte die derzeitige Qualität der guten Herstellungspraxis (cGMP) unter Verwendung einer Zelllinie, obwohl es sich nicht um eine humane pluripotente Stammzelle handelte⁵. Das hier beschriebene automatisierte Kultursystem wurde nun speziell mit dem Ziel entwickelt, Laborexperimente zu unterstützen (Abbildung 1). Es verfügt jedoch über genügend Systeme, um saubere Werte zu halten, die einer Sicherheitswerkbank der Stufe IV entsprechen.

Protokoll

Die Ethikkommission der Kansai Medical University genehmigte die Generierung und Verwendung der gesunden iPS-Zellen aus Freiwilligen mit dem Namen KMUR001 (Zulassung Nr. 2020197). Der Spender, der offen rekrutiert wurde, gab eine formelle Einverständniserklärung ab und stimmte der wissenschaftlichen Verwendung der Zellen zu.

HINWEIS: Die aktuelle Benutzeroberfläche (die spezielle Software mit dem Namen "ccssHMI", die unter dem Betriebssystem Windows XP läuft) ist der grundlegende Bedienbildschirm. Unter der oben genannten Schnittstelle sind eine Reihe von Registerkarten angeordnet, mit denen Benutzer verschiedene Vorgänge einleiten können.

1. Ladevorgänge

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf dem oberen Bildschirm der Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ladevorbereitung starten .
2. Stellen Sie die Schale(n) oder Platte(n), die in das Gerät eingegeben werden soll(en) in Position im Gerät ist/stellen.
   HINWEIS: Die notwendigen Informationen zur Identifizierung des Gerichts sollten auf jedem Deckel angegeben werden.
3. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.
4. Wählen Sie in der Software die Art und Menge der Gerichte oder Teller aus.
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ladevorbereitung abgeschlossen . Klicken Sie auf die Schaltfläche Ladestart .
6. Nachdem eine Schale in das System hochgeladen wurde, wählen Sie die Informationen auf der Schüssel, z. B. mit iPS-Zellen oder ohne iPS-Zellen, in der Software aus. Registrieren Sie Notizen zu jedem Gericht in der Software.
7. Klicken Sie am Ende auf die Schaltfläche Registrierung , um den Ladevorgang abzuschließen.

2. Entladevorgang

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen auf dem oberen Bildschirm der Software. Wählen Sie die zu entfernende(n) Schüssel(n) in der Software aus.
2. Nachdem Sie das/die Gericht(e) ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Start der Entladevorbereitung . Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladestart .
3. Nachdem die Schale(n) vom Inkubator auf die Werkbank im System übertragen wurde(n), drücken Sie die Taste Dish Removal .
4. Öffnen Sie manuell das vordere Schiebefenster und nehmen Sie die Schale(n) heraus. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.

3. Ergänzung von Verbrauchsmaterialien: Pipetten, Röhrchen und Medium

1. Um Verbrauchsmaterialien wie Pipetten, Röhrchen und Medium aufzufüllen, klicken Sie auf dem oberen Bildschirm der Software auf die Schaltfläche Verbrauchsmaterialien und wählen Sie dann den Artikel aus, der aufgefüllt werden soll.
   1. Pipetten
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pipette . Wählen Sie die Schaltfläche Auffüllen aus .
      2. Wählen Sie in der Software ein Rack aus, das der Benutzer auffüllen möchte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start auffüllen .
      3. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Deckel des Pipettenlagerbereichs auf der Werkbank geöffnet ist, öffnen Sie manuell das vordere Schiebefenster und füllen Sie die Pipetten nach Bedarf nach.
      4. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auffüllung einrichten und geben Sie die Informationen für die Auffüllung ein, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung .
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
   2. Rohre
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Tube . Wählen Sie die Schaltfläche Auffüllen aus .
      2. Wählen Sie in der Software ein Rack aus, das der Benutzer auffüllen möchte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start auffüllen .
      3. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Gestell nach oben verschoben wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Röhrchen auffüllen .
      4. Öffnen Sie das vordere Schiebefenster manuell und füllen Sie die Rohre nach Bedarf auf.
      5. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
      7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auffüllung einrichten und geben Sie die Informationen für die Auffüllung ein, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung . Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen .
   3. Mittel
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Mittel . Wählen Sie die Schaltfläche Auffüllen in der Software aus.
      2. Wählen Sie eines von drei Racks aus, die die Benutzer auffüllen möchten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start auffüllen .
      3. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Deckel des Medium-Lagerbereichs geöffnet wurde, öffnen Sie manuell das vordere Schiebefenster und füllen Sie das Medium nach.
      4. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auffüllen und geben Sie die Informationen für das Medium ein, einschließlich des Namens und der Menge des Mediums. Geben Sie bei Bedarf zusätzliche Kommentare ein.
      7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Registrierung .
      8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen .

4. Auswahl der Aufgabe

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Task auf dem oberen Bildschirm der Software.
2. Wählen Sie die Schaltfläche Aufgabeneinstellung aus. Wählen Sie die gewünschte Aufgabe aus der Aufgabenliste aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Nächster Schritt .
3. Geben Sie das Datum und die Uhrzeit zum Ausführen der Aufgabe an, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung . Wählen Sie ein Gericht oder einen Teller aus, um die Aufgabe auszuführen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung .
4. Nachdem Sie die ausgewählte Aufgabe erneut bestätigt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Registrierung . Vergewissern Sie sich, dass die Aufgabe auf dem nächsten Bildschirm registriert wurde.
5. Legen Sie bei Bedarf die nächste Aufgabe auf die gleiche Weise fest.
6. Klicken Sie am Ende auf die Schaltfläche Start . Dann wird die Aufgabe automatisch zum angegebenen Datum und zur angegebenen Uhrzeit gestartet.
   HINWEIS: Unmittelbar nach Beendigung jeder Aufgabe schalten sich die UV-Lampen (an zwei Seiten der Haube) automatisch ein und werden nach 5-30 Minuten gemäß der Zusatzeinstellung ausgeschaltet, um die Haube in aseptischem Zustand zu halten. Zum Beenden können Benutzer auf die Schaltfläche Start klicken.
7. Wenn Benutzer eine geplante Aufgabe im Voraus abbrechen möchten, klicken Sie auf die Schaltfläche Beenden .
8. Nachdem Sie die Aufgabe ausgewählt haben, die abgebrochen werden soll, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufgabe bearbeiten .
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufgabe abbrechen . Bestätigen Sie auf dem nächsten Bildschirm, dass die Aufgabe gelöscht wurde.

5. Überprüfen Sie die Zellenbilder

1. Jede Aufgabe beinhaltet mikroskopische Beobachtungen (Fotografieren) vor und nach der Aufgabenarbeit. Beobachten Sie den Fortschritt der Zellkultur fotografisch, indem Sie vor oder nach jeder Aufgabe eine mikroskopische Fotoaufgabe einbauen.
2. Wählen Sie voreingestellte Aufgabenprogramme aus, einschließlich der Auswahl mehrerer spezifischer Positionen der Schale oder der Well-Platte im Voraus für die Festpunktbeobachtung, um dieselbe Position im Laufe der Zeit zu überwachen.

6. Passage und Differenzierung

1. Befolgen Sie die Schritte in den Abschnitten 1-5 und stellen Sie das automatisierte Zellkultursystem so ein, dass es eine Passage und Differenzierung durchführt. Die Geräteeinstellungen für die Passage, die Kardiomyozytendifferenzierung, die Hepatozytendifferenzierung, die Differenzierung der neuralen Vorläuferzellen und die Keratinozytendifferenzierung sind in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4 bzw. Tabelle 5 dargestellt.

Ergebnisse

Erhaltung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen
Wir haben drei hPSC-Linien (RIKEN-2F, 253G1 und KMUR001) verwendet. Wir haben das Wartungsprotokoll durch täglich manuell durchgeführte Experimente optimiert und die detaillierten Programme durch die sieben Vorversuche, die das System durchführt, weiter optimiert. Zum Beispiel sind die Scherspannungen, die durch die Flüssigkeitsgeschwindigkeiten des Spießflusses von verschiedenen Pipetten verursacht werden, die von Menschen und dem System ge...

Diskussion

Ein wichtiger Schritt im Protokoll besteht darin, dass ein Benutzer, wenn er Fehler findet, jederzeit auf die Schaltfläche "Abbrechen", "Beenden" oder "Zurücksetzen" klicken und mit dem ersten Schritt beginnen kann. Die Software kann menschliche Fehler vermeiden, wie z. B. Doppelbuchungen, das Öffnen von Türen, während die Systemaufgaben aktiv sind, und mangelnden Nachschub. Ein weiterer kritischer Punkt für eine erfolgreiche und effiziente Differenzierung zur gewünschten somatischen Zelle ist die richtige Auswahl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A