משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

Summary

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

Abstract

ריפוי גנטי הוא טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לספק גנים חדשים לחולה לטיפול במחלה, בין אם זה להחדיר גן פונקציונלי, להשבית גן רעיל, או לספק גן שהתוצר שלו יכול לווסת את הביולוגיה של המחלה. שיטת המסירה של הווקטור הטיפולי יכולה ללבוש צורות רבות, החל מעירוי תוך ורידי למסירה מערכתית ועד הזרקה ישירה לרקמת המטרה. עבור הפרעות נוירודגנרטיביות, לעתים קרובות רצוי להטות את הטרנסדוקציה לכיוון המוח ו / או חוט השדרה. הגישה הכי פחות פולשנית למיקוד מערכת העצבים המרכזית כולה כוללת הזרקה לנוזל השדרה (CSF), מה שמאפשר לטיפול להגיע לחלק גדול ממערכת העצבים המרכזית. הגישה הבטוחה ביותר להעברת וקטור לתוך CSF היא הזרקה intrathecal מותני, שבו מחט מוחדרת לתוך בור מותני של חוט השדרה. טכניקה זו, הידועה גם בשם ניקור מותני, נמצאת בשימוש נרחב במכרסמים יילודים ובוגרים ובמודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שהטכניקה דומה בין מינים ושלבי התפתחות, הבדלים עדינים בגודל, במבנה ובגמישות של רקמות המקיפות את החלל התוך-תאי דורשים התאמות בגישה. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ניקור מותני בחולדות צעירות כדי לספק וקטור סרוטיפ 9 הקשור לאדנו. כאן, 25-35 μL של וקטור הוזרקו לתוך הבור המותני, וכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש כדי להעריך את פרופיל ההתמרה כתוצאה מכל זריקה. היתרונות והאתגרים של גישה זו נדונים.

Introduction

ההבטחה של טיפולים גנטיים בתיווך ויראלי סוף סוף התגשמה בשנים האחרונות עם אישור ה- FDA לטיפולים לאטרופיה של שרירי עמוד השדרה, ניוון רשתית, המופיליה פקטור IX, סרטן ועוד 1,2,3,4. אינספור טיפולים אחרים נמצאים כעת בפיתוח. ריפוי גנטי נועד להעביר גן טיפולי לתאי המטופל. תוצרי הגן החדש יכולים להחליף את הפעילות החסרה בגן אנדוגני לקוי, לעכב גן רעיל, להרוג תאים סרטניים או לספק תפקוד מועיל אחר.

עבור מחלות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS), העברת וקטור הטיפול הגנטי ישירות לרקמת המטרה היא לעתים קרובות רצויה. גישות לא מערכתיות מספקות שני יתרונות: הן ממזערות תופעות לוואי מחוץ למטרה שעלולות להיגרם על ידי התמרה היקפית, והן מפחיתות מאוד את כמות הווקטור הדרושה להשגת רמות נאותות של התמרה ברקמת המטרה⁵.

ישנן מגוון גישות להעברת וקטורים של ריפוי גנטי למערכת העצבים המרכזית. הזרקה Intraparenchymal, הזרקה של וקטור ישירות לתוך חוט השדרה או רקמת המוח, יכול לשמש למסירה לאזור מוגדר. עם זאת, עבור מחלות רבות, transduction רחב של CNS רצוי. ניתן להשיג זאת על ידי העברת וקטור לנוזל השדרה (CSF)⁵, הנוזל שזורם בתוך ומסביב למוח ולחוט השדרה. ישנן שלוש דרכים עיקריות להעביר וקטורים ל- CSF. הגישה הפולשנית ביותר היא העברה תוך-מוחית, הכוללת קידוח חור בור דרך הגולגולת והתקדמות מחט דרך המוח לתוך החדרים הרוחביים. זה מניב התמרה בכל המוח. עם זאת, ההליך עלול לגרום לדימום תוך גולגולתי, והגישה בדרך כלל מייצרת רק התמרה מוגבלת של חוט השדרה⁶. הזרקה לתוך cisterna magna בבסיס הגולגולת היא פחות פולשנית, אבל נושאת את הסיכון של נזק לגזע המוח. בעוד שלעתים קרובות נעשה שימוש במחקר בבעלי חיים⁵, הזרקה לתוך cisterna magna כבר לא בשימוש שגרתי במרפאה⁷. ניקור מותני הוא הגישה הכי פחות פולשנית לגישה ל- CSF. זה כרוך בהחדרת מחט בין שתי חוליות מותניות לתוך בור המותני.

ניקור מותני למסירה וקטורית מבוצע באופן שגרתי בחולדות ועכברים בוגרים ובעכברים ילודים ^8,9. מחברי מחקר זה ביצעו לאחרונה ניקורים מותניים בחולדות צעירות (גיל 28-30 יום) כדי לספק וקטורים של סרוטיפ 9 הקשור לנגיף אדנו (AAV9). בחולדות בוגרות, מחט ניקוב מותני בילוד הונחה במאונך בין חוליות L3 ו-L4⁹. מיקום נכון גורם לתנועת זנב ו-CSF לזרום למעלה לתוך מאגר המחטים. בחולדות צעירות, לעומת זאת, לא ניתן היה להשיג אף אחת מהקריאות הללו. לאחר מכן ניסו החוקרים להתאים הליך עכברי בוגר באמצעות מזרק אינסולין 27 גרם שהוחדר בזווית בין L5 ל-L6¹⁰. בעכברים בוגרים, שהם בדרך כלל קטנים יותר מחולדות P28, זה לא מייצר תנועת זנב, אבל מיקום מחט שגוי ניכר על ידי זרימה חוזרת של ההזרקה. בחולדות צעירות, לעומת זאת, גישה זו הובילה באופן אחיד להעברת ההזרקה באופן אפידורלי, ככל הנראה כתוצאה מגמישות שונה בין עכברים בוגרים לחולדות צעירות של שכבות הרקמה המקיפות את חוט השדרה. גישות הצנתר נבדקו בהמשך. באופן ספציפי, קטטר הוכנס דרך חתך בדורה של בור המים המותני ועד חוט השדרה באמצע בית החזה; עם זאת, גישה זו הובילה לרפלוקס משמעותי של ההזרקה חזרה ממקום החתך במהלך הלידה. גם ניסיונות להחדיר את הצנתר לחלל התוך-תאי באופן מלעורי באמצעות מחט מנחה לא צלחו. בשל הצרה של הרוחב הבין-למינרי, סביר להניח שהקטטר יפגע בלמינה הרוסטרלית ולא יתקדם.

כאן, מתוארת שיטה להשגת אספקת פתרון מוצלחת וניתנת לשחזור באמצעות ניקור מותני בחולדה הצעירה. גישה זו יכולה לשמש עבור וקטורים נגיפיים, וככל הנראה גם עבור תאים, תרופות וטיפולים אחרים.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אמורי (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי (גיל 28-30 יום, מסה בטווח של כ-90-135 גרם, זכרים ונקבות).

1. הכנת הווקטור

1. הפשירו את וקטור AAV9 (ראו טבלת חומרים) על קרח בתחילת ההליך.
2. צנטריפוגה צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הווקטור לזמן קצר בצנטריפוגה שולחנית כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית הצינור.
3. סובב בעדינות את צינור המיקרוצנטריפוגה כדי לוודא שהתמיסה מעורבבת היטב.

2. הכנת כלוב ההתאוששות

1. הניחו כלוב נקי על שמיכה חשמלית (ראו טבלת חומרים) כך שרק מחצית הכלוב יהיה במגע עם השמיכה.
2. הגדר את טמפרטורת השמיכה ל ~ 37 ° C.

3. הכנת הפלטפורמה הכירורגית

1. יש לחמם פד איזותרמי (ראו טבלת חומרים) ל-39°C במיקרוגל או באמבט מים, כך שהתכולה תהפוך לנוזלית.
2. הניחו את הפד האיזותרמי על משטח הניתוח וכסו אותו בכרית ספסל סופגת ונקייה.

4. הכנת בעלי חיים

1. מרדימים את החולדות באיזופלורן בקופסה שקופה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). התחל את השראת ההרדמה באמצעות 5% isoflurane, ולרדת 1% לדקה עד להגיע 2%. החזיקו את בעל החיים ב-2% למשך 3 דקות נוספות.
2. הזיזו את הקופסה המחזיקה את החיה למכסה אדים ופתחו את הקופסה.
   הערה: זה מגביל את החשיפה של המנתח להרדמה.
3. הסר את השיער מגבו של בעל החיים באמצעות קוצצי שיער חשמליים.
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בקרם פיגול או קרם גילוח וגילוח ידני.
4. הניחו את בעל החיים על משטח הניתוח עם חוטמו בחרוט האף של ההרדמה.
   הערה: בעל החיים עשוי להתחיל לחזור להכרה בזמן שהפרווה מוסרת מאתר הניתוח. אם זה קורה, להרדים אותו שוב כמתואר לעיל.
5. יש למרוח משחת עיניים מסככת על כל עין כדי למנוע התייבשות של הקרניות במהלך ההליך.
6. לחטא את אזור הניתוח באמצעות שלושה יישומים לסירוגין של פובידון-יוד ומגבוני איזופרופנול.
7. להזריק את משככי הכאבים תת עורית.
   הערה: Buprenorphine משמש בדרך כלל במינון של 0.01-0.05 מ"ג / ק"ג, נתון כל 12 שעות. לחלופין, צורה שחרור איטי של תרופה זו יכולה להינתן פעם אחת ב 1 מ"ג / ק"ג כדי לספק שליטה נאותה בכאב במשך 72 שעות. התייעצו עם IACUC של המוסד לגבי ההנחיות שלהם לגבי טיפול בכאב.
8. יש להזריק 100 μL של לידוקאין 1% תת עורית מעל התהליכים בעמוד השדרה L2 עד L6 כדי לספק הרדמה מקומית.
9. מניחים גליל של מגבת נייר או צינור בקוטר 1.5 ס"מ מתחת לחיה, רק רוסטרל לירכיים. זה עוזר להגמיש את עמוד השדרה, מה שמקל על החדרת המחט בין שתי הלמינה.
10. הניחו וילון עם פנסטרציה (ראו טבלת חומרים) על החיה, ומרכזו את הפנסטרציה מעל עמוד השדרה המותני.

5. חשיפת עמוד השדרה המותני

1. אשרו את עומק ההרדמה על ידי צביטת כל אחת מכפותיו של בעל החיים וחפשו היעדר תגובת נסיגה.
2. באמצעות להב אזמל #11, ליצור חתך באורך של כ 3 ס"מ בעור במורד קו האמצע מ L2 עד L6.
3. שחררו את העור מהשריר על ידי החדרת זוג מספריים כירורגיים מעוקלים סטריליים בין השריר לעור ולאחר מכן פתיחת הקצוות.
4. הסר את הפאשיה המכסה את תהליכי עמוד השדרה L2-L5.

6. טעינת המזרק

1. פיפטה 25-35 μL של הווקטור (כדי להשיג את המינון הרצוי) לתוך המכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
2. משכו את כל הנפח לתוך מזרק האינסולין.
   הערה: יש להקפיד לא לשאוב אוויר במהלך תהליך זה.

7. ביצוע ההזרקה

1. זהה את תהליכי עמוד השדרה L5 ו- L4.
   הערה: L6 יושב ישירות בין שני הפסגות האיליאק, והתהליך הספינסי שלו צריך להיות קל לזיהוי על ידי חיטוט עם מכשיר קהה. לאחר מכן ניתן להריץ את המכשיר בעדינות במעלה החלק האחורי כדי למצוא את גבולות תהליכי L5 ו- L4.
2. הניחו יד אחת כך שהאגודל יונח בעדינות על זנב החיה ורגל אחת. השתמש באצבע כדי לייצב את המזרק.
3. מקם את המחט של המזרק כך שהוא משמאל לתהליך עמוד השדרה L5 ומסודר עם קצהו הקאודלי. מקמו את המזרק כך שהוא יהיה במרחק של כ-30° מקו האמצע וכ-30° למעלה ממישור השולחן.
   הערה: ייתכן שיהיה מועיל להשתמש במיקרוסקופ כירורגי כדי לזהות טוב יותר ציוני דרך ולמקם את קצה המחט.
4. מקדמים את מחט המזרק קדימה כ-8 מ"מ, מעל החלק העליון של למינה L5 ולאחר מכן מתחת ללמינה L4 לתוך בור המים המותני עד לפגיעה בעצם. מיקום נכון יגרום לעווית של הרגל ו/או הזנב שניתן לראות או להרגיש על ידי האגודל המונח על הרגל/זנב. אם אין עווית, הסר את המחט ונסה את ההליך מצד שמאל. אם עדיין אין עווית, חזור על ההליך בין L4/L3 ו-L3/L2 לפי הצורך.
5. לחץ על הבוכנה באיטיות במשך כ 5 שניות.
   הערה: ייתכן שיש עווית ברגל או בזנב במהלך ההזרקה.
6. החזיקו את המזרק במקומו למשך כ-30 שניות לאחר לחיצה מלאה על הבוכנה כדי לאפשר ללחץ להתאזן ולמזער את הריפלוקס של ההזרקה כאשר המחט נסוגה.
7. הסר לאט את המחט.

8. סגירת החתך

1. קירוב לקצוות החתך.
2. החל מקצה אחד של הפצע, השתמש בתפר 4-0 (ראה טבלת חומרים) או סיכות כירורגיות כדי לסגור את החתך.

9. התאוששות וניטור

1. הכניסו את בעל החיים לכלוב שחומם מראש.
2. בדוק את בעל החיים לפחות כל 15 דקות עד שהוא אמבולטורי לחלוטין.
   הערה: פעולה זו אמורה להימשך בין 15 דקות ל-45 דקות.
3. במשך שלושת הימים הבאים, בצעו בדיקות בריאות לפחות מדי יום. לספק משככי כאבים במשך היומיים הראשונים לאחר הניתוח או לפי דרישת IACUC.
4. שבוע לאחר הניתוח, יש להסיר את התפרים או הסיכות.

10. הליך מעקב

הערה: כדי לקבוע את הדיוק של טכניקת ההזרקה, הזריקו צבע כחול טריפאן כמתואר לעיל ולאחר מכן הרדימו מיד את בעל החיים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסדות) ובצעו כריתת למינקטומיה כדי לדמיין את התוצאה.

1. בעוד בעל החיים נשאר תחת הרדמה, להרדים אותו על ידי מתן מנה קטלנית של pentobarbital באמצעות הזרקה intraperitoneal במינון של 150 מ"ג / ק"ג.
2. לאחר הפסקת הנשימה ופעילות הלב, יש לפתוח את חלל החזה כדי להבטיח מוות. האריכו את החתך הניתוחי במעלה הגב לצוואר.
3. בצע חתך באורך 4 ס"מ לתוך השריר במקביל לעמוד השדרה משני צידי התהליכים בעמוד השדרה, תוך שמירה קרובה ככל האפשר לתהליכים.
4. בעזרת מלקחיים עדינים או מספריים, הסר את השריר בין התהליכים בעמוד השדרה.
5. הסר את התהליכים בעמוד השדרה מ- L6 עד לעמוד השדרה התחתון של בית החזה באמצעות רונגר (ראה טבלת חומרים). הימנעו מתנועות פיתול, מכיוון שהדבר עלול לפגוע ברונג'ורים.
6. הכנס את הקצה התחתון של הרונגר מתחת ללמינה L5 והסר את העצם מעל חוט השדרה על ידי לקיחת מספר "עקיצות" ממנו.
   הערה: משיכה לאחור של תהליך עמוד השדרה L6 יכולה להקל על הכנסת קצה הרונגר. יש להקפיד על מניעת נזק לחוט השדרה.
7. המשך להרחיב את laminectomy לפחות ארבע laminae rostrally. בדוק את פני השטח הפנימי של laminae עבור סימנים של צבע, אשר יכול להצביע על הזרקה נכשלת.

תוצאות

כדי לקבוע את הדיוק של טכניקת ההזרקה, צבע, טריפאן כחול, שימש כפונדקאית לטיפול. צבע זה נקשר בקלות לחלבונים, כך שהוא בדרך כלל נשאר בתוך המבנה שלתוכו הוא הוזרק. משמעות הדבר היא שהצבע עשוי שלא לחזות במדויק את התפלגות הטיפול לאחר ההזרקה; הוא משמש פשוט כדי לחשוף את הדיוק של ההזרקה. כאשר הוא מוכנס בה?...

Discussion

מגוון רחב של מחלות משפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מתן עותק פונקציונלי של הגן הרלוונטי באמצעות וקטור נגיפי היא אסטרטגיית טיפול אטרקטיבית עבור אלה שהם רצסיביים ומונוגניים בטבע, כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה. עם זאת, מחסום הדם-מוח (BBB) אינו כולל את רוב וקטורי הריפוי הגנטי הניתנים תוך ורידי

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection