Интратекальное введение вектора молодым крысам путем инъекции поясничного отдела цистерны

Резюме

Описана хирургическая методика выполнения инъекций в поясничный резервуар молодого крыса. Этот подход использовался для интратекальной доставки векторов генной терапии, но ожидается, что этот подход может быть использован для различных терапевтических средств, включая клетки и лекарственные препараты.

Аннотация

Генная терапия — это мощная технология доставки новых генов пациенту для лечения заболевания, будь то введение функционального гена, инактивация токсичного гена или предоставление гена, продукт которого может модулировать биологию заболевания. Метод доставки терапевтического вектора может принимать различные формы, начиная от внутривенной инфузии для системной доставки и заканчивая прямым введением в ткань-мишень. При нейродегенеративных расстройствах часто желательно смещение трансдукции в сторону головного и/или спинного мозга. Наименее инвазивный подход к воздействию, направленный на всю центральную нервную систему, включает в себя инъекции в спинномозговую жидкость (ликвор), что позволяет терапевтическому эффекту достичь значительной части центральной нервной системы. Наиболее безопасным подходом для введения вектора в спинномозговую жидкость является поясничная интратекальная инъекция, при которой игла вводится в поясничный резервуар спинного мозга. Этот метод, также известный как люмбальная пункция, широко используется у новорожденных и взрослых грызунов, а также на крупных моделях животных. Несмотря на то, что метод схож у разных видов и стадий развития, тонкие различия в размере, структуре и эластичности тканей, окружающих интратекальное пространство, требуют аккомодации в подходе. В данной статье описан метод проведения люмбальной пункции у молодых крыс с целью доставки аденоассоциированного вектора серотипа 9. Здесь 25-35 мкл вектора вводили в поясничный отдел позвоночника, а для оценки профиля трансдукции, полученного в результате каждой инъекции, использовали репортер зеленого флуоресцентного белка (GFP). Обсуждаются преимущества и проблемы такого подхода.

Введение

Перспектива вирусно-опосредованной генной терапии, наконец, была реализована в последние годы с одобрением FDA методов лечения спинальной мышечной атрофии, дистрофии сетчатки, гемофилии фактора IX, рака ^{и других заболеваний}. В настоящее время в разработке находится бесчисленное множество других терапевтических средств. Генная терапия направлена на доставку терапевтического гена в клетки пациента. Продукты этого нового гена могут замещать недостающую активность дефицитного эндогенного гена, ингибировать токсичный ген, убивать раковые клетки или выполнять какую-либо другую полезную функцию.

При заболеваниях, поражающих центральную нервную систему (ЦНС), часто бывает желательно доставить вектор генной терапии непосредственно в ткань-мишень. Несистемные подходы имеют два преимущества: они минимизируют побочные эффекты, которые могут быть вызваны периферической трансдукцией, и значительно уменьшают количество вектора, необходимого для достижения адекватных уровней трансдукции^{в целевой ткани}.

Существует множество подходов к доставке векторов генной терапии в ЦНС. Интрапаренхиматозная инъекция, то есть инъекция вектора непосредственно в спинной мозг или ткань головного мозга, может быть использована для доставки в определенную область. Однако при многих заболеваниях желательна широкая трансдукция ЦНС. Это может быть достигнуто путем доставки вектора к спинномозговой жидкости (СМЖ)⁵, жидкости, которая течет в головном и спинном мозге и вокруг них. Существует три основных способа доставки векторов в спинномозговую жидкость. Наиболее инвазивным подходом является внутримозговая доставка, которая включает в себя сверление отверстия в черепе и продвижение иглы через мозг в боковые желудочки. Это приводит к трансдукции по всему мозгу. Тем не менее, процедура может вызвать внутричерепное кровоизлияние, и этот подход обычно приводит лишь к ограниченной трансдукции спинного мозга⁶. Инъекция в большую цистерну у основания черепа менее инвазивна, но несет риск повреждения ствола мозга. Несмотря на то, что инъекции в большую цистерну часто используются в исследованиях на животных⁵, они больше не используются рутинно в клинике⁷. Люмбальная пункция является наименее инвазивным подходом к доступу к спинномозговой жидкости. Это включает в себя введение иглы между двумя поясничными позвонками и в поясничный бачок.

Люмбальная пункция для доставки вектора обычно выполняется у взрослых крыс и мышей, а также у неонатальных мышей ^8,9. Авторы этого исследования недавно провели люмбальную пункцию у молодых крыс (в возрасте 28-30 дней) для доставки векторов аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9). У взрослых крыс неонатальная игла для люмбальной пункции была размещена вертикально между позвонками L3 и L4⁹. Правильное размещение приводит к взмаху хвостом и стеканию спинномозговой жидкости в игольчатый резервуар. Однако у молодых крыс ни одно из этих показаний не могло быть достигнуто. Затем авторы попытались адаптировать процедуру на взрослой мыши, используя инсулиновый шприц с концентрацией 27 г, вставленный под углом между L5 и L6¹⁰. У взрослых мышей, которые обычно меньше, чем крысы P28, это не приводит к взмаху хвоста, но неправильное размещение иглы очевидно по обратному потоку инъекции. Однако у молодых крыс этот подход одинаково приводил к эпидуральной стимуляции инъекции, что, вероятно, является результатом разной эластичности слоев тканей, окружающих спинной мозг у взрослых мышей и молодых крыс. Далее оценивались катетерные доступы. В частности, катетер вводили через разрез в твердой мозговой оболочке поясничного отдела и до средней части грудного отдела спинного мозга; Однако такой подход приводил к значительному оттоку инъекции обратно из места разреза во время родов. Попытки ввести катетер в интратекальное пространство чрескожно с помощью направляющей иглы также не увенчались успехом. Из-за узкой межслойной ширины катетер, скорее всего, заденет ростральную пластинку и не сможет продвинуться вперед.

В данной работе описан метод достижения успешной и воспроизводимой доставки раствора с помощью люмбальной пункции у молодых крыс. Этот подход может быть использован для вирусных векторов, а также, вероятно, для клеток, фармацевтических препаратов и других терапевтических средств.

протокол

Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори. В настоящем исследовании использовались крысы Спрэг-Доули (возраст 28-30 дней, масса около 90-135 г, самцы и самки).

1. Подготовка вектора

1. Разморозьте вектор AAV9 (см. Таблицу материалов) на льду в начале процедуры.
2. Кратковременно центрифугируйте микроцентрифужную пробирку, содержащую вектор, в настольной центрифуге, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне пробирки.
3. Осторожно переверните микроцентрифужную пробирку, чтобы убедиться, что раствор хорошо перемешался.

2. Подготовка каркаса для восстановления

1. Поместите чистую клетку на электрическое одеяло (см. Таблицу материалов) так, чтобы только половина клетки соприкасалась с одеялом.
2. Установите температуру одеяла на ~37 °C.

3. Подготовка операционной платформы

1. Нагрейте изотермическую прокладку (см. Таблицу материалов) до 39 °C в микроволновой печи или на водяной бане, чтобы содержимое стало жидким.
2. Поместите изотермическую прокладку на хирургическую платформу и накройте ее чистой впитывающей скамьей.

4. Подготовка животных

1. Обезболите крыс изофлураном в прозрачной коробке (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Начните индукцию анестезии с 5% изофлурана и снижайте ее на 1% в минуту до достижения 2%. Удерживайте животное при температуре 2% еще 3 минуты.
2. Переместите коробку, удерживающую животное, в вытяжной шкаф и откройте коробку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограничивает воздействие анестетика на хирурга.
3. Удалите шерсть со спины животного с помощью электрических машинок для стрижки волос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать крем для депиляции или ручную бритву и крем для бритья.
4. Поместите животное на операционную платформу мордой в носовой конус для анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное может начать приходить в сознание во время удаления шерсти с места операции. Если это произошло, сделайте ему еще раз обезболивание, как описано выше.
5. Нанесите смазывающую глазную мазь на каждый глаз, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время процедуры.
6. Продезинфицируйте операционную область с помощью трех чередующихся применений салфеток с повидон-йодом и изопропанолом.
7. Введите анальгетик (анальгетики) подкожно.
   Примечание: Бупренорфин обычно применяют в дозе 0,01-0,05 мг/кг, вводят каждые 12 ч. В качестве альтернативы, можно однократно ввести форму этого препарата с медленным высвобождением в дозе 1 мг/кг для обеспечения адекватного контроля боли в течение 72 ч. Проконсультируйтесь с IACUC учреждения для получения рекомендаций по лечению боли.
8. Введите 100 мкл 1% лидокаина подкожно над остистыми отростками от L2 до L6 для обеспечения местной анестезии.
9. Подложите под животное рулон бумажного полотенца или трубку диаметром 1,5 см, как раз рострально к бедрам. Это помогает согнуть позвоночник, облегчая введение иглы между двумя пластинками.
10. Наложите фенестрированную простыню (см. Таблицу материалов) на животное, расположив фенестрацию по центру поясничного отдела позвоночника.

5. Обнажение поясничного отдела позвоночника

1. Подтвердите глубину анестезии, ущипнув каждую из лап животного и ища отсутствие реакции отмены.
2. С помощью лезвия скальпеля #11 сделайте разрез длиной около 3 см на коже по средней линии от L2 до L6.
3. Отделите кожу от мышцы, вставив стерильные изогнутые хирургические ножницы между мышцей и кожей, а затем раскройте кончики.
4. Удалите фасцию, покрывающую остистые отростки L2-L5.

6. Загрузка шприца

1. Пипеткой внесите 25-35 мкл вектора (для достижения нужной дозы) в колпачок стерильной микроцентрифужной пробирки.
2. Наберите весь объем в инсулиновый шприц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы во время этого процесса не набирался воздух.

7. Выполнение инъекции

1. Определите остистые отростки L5 и L4.
   Примечание: L6 находится непосредственно между двумя гребнями подвздошной кости, и его остистый отросток должен быть легко идентифицирован путем зондирования тупым инструментом. Затем инструмент можно аккуратно провести вверх по задней панели, чтобы найти границы процессов L5 и L4.
2. Положите одну руку так, чтобы большой палец мягко лег на хвост животного, а другую ногу положите на него. С помощью пальца закрепите шприц.
3. Расположите иглу шприца так, чтобы она находилась слева от остистого отростка L5 и выровнялась с его хвостовым концом. Расположите шприц так, чтобы он находился примерно на 30° от средней линии и на 30° вверх от плоскости стола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно использовать хирургический микроскоп для лучшего определения ориентиров и позиционирования кончика иглы.
4. Продвиньте иглу шприца вперед примерно на 8 мм, через верхнюю часть пластинки L5, а затем под пластинку L4 в поясничный бачок, пока кость не будет поражена. Правильная постановка приведет к подергиванию ноги и/или хвоста, которое можно увидеть или почувствовать по большому пальцу, лежащему на ноге/хвосте. Если подергивания нет, извлеките иглу и попробуйте провести процедуру с левой стороны. Если подергивания по-прежнему нет, при необходимости повторите процедуру между L4/L3 и L3/L2.
5. Медленно нажмите на поршень в течение примерно 5 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции может наблюдаться подергивание ноги или хвоста.
6. Удерживайте шприц на месте в течение примерно 30 с после полного нажатия на поршень, чтобы обеспечить равновесие давления и свести к минимуму рефлюкс инъекции при извлечении иглы.
7. Медленно извлеките иглу.

8. Закрытие разреза

1. Приблизьтесь к краям разреза.
2. Начиная с одного конца раны, используйте шов 4-0 (см. Таблицу материалов) или хирургические скобки, чтобы закрыть разрез.

9. Восстановление и мониторинг

1. Поместите животное в заранее разогретую клетку.
2. Проверяйте животное не реже одного раза в 15 минут до тех пор, пока оно не станет полностью амбулаторным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно занять от 15 до 45 минут.
3. В течение следующих трех дней проводите проверки состояния здоровья не реже одного раза в день. Предоставляйте анальгетики в течение первых 2 дней после операции или в соответствии с требованиями IACUC.
4. Через неделю после операции снимите швы или скобы.

10. Порядок последующих действий

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить точность техники инъекции, введите трипановый синий краситель, как описано выше, а затем немедленно усыпьте животное (следуя утвержденным в учреждении протоколам) и выполните ламинэктомию для визуализации результата.

1. Пока животное остается под наркозом, усыпьте его, введя смертельную дозу пентобарбитала через внутрибрюшинную инъекцию в дозе 150 мг/кг.
2. Как только дыхание и сердечная деятельность прекратятся, откройте грудную полость, чтобы обеспечить смерть. Продлите хирургический разрез вверх по задней части к шее.
3. Сделайте надрез длиной 4 см в мышце, параллельной позвоночнику, с обеих сторон остистых отростков, держа как можно ближе к отросткам.
4. С помощью тонких щипцов или ножниц удалите мышцу между остистыми отростками.
5. Удалите остистые отростки от L6 до нижнегрудного отдела позвоночника с помощью ронжера (см. Таблицу материалов). Избегайте скручивающих движений, так как это может повредить ронжеры.
6. Вставьте нижний кончик ронжера под пластинку L5 и удалите кость, лежащую над спинным мозгом, вынув из нее несколько «откусов».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оттягивание остистого отростка L6 может облегчить введение кончика ронжера. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить повреждения спинного мозга.
7. Продолжайте расширять ламинэктомию по крайней мере на четыре пластинки рострально. Осмотрите внутреннюю поверхность пластинок на наличие признаков красителя, которые могут свидетельствовать о неудачной инъекции.

Результаты

Чтобы определить точность техники инъекции, в качестве суррогата терапевтического препарата был использован краситель трипановый синий. Этот краситель легко связывается с белками, поэтому он обычно остается в структуре, в которую был введен. Это означает, что краситель может неточно ?...

Обсуждение

Самые разнообразные заболевания поражают ЦНС. Предоставление функциональной копии соответствующего гена с помощью вирусного вектора является привлекательной стратегией лечения рецессивных и моногенных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия. Тем не менее, гематоэнцефал...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection