מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

Abstract

סיבוכים לאחר השתלת ריאות קשורים במידה רבה למערכת החיסון המארחת המגיבה לשתל. תגובות חיסוניות כאלה מווסתות על ידי הצלבה בין תאי התורם והמקבל. הבנה טובה יותר של תהליכים אלה מסתמכת על שימוש במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ונעזרת ביכולת לחקור סחר בתאי מערכת החיסון בזמן אמת. ניתן להשתמש במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים כדי לצלם רקמות ואיברים לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם נזק מינימלי לאור, מה שמקנה יתרון גדול על פני מיקרוסקופ קונפוקלי של פוטון יחיד. שימוש סלקטיבי בעכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ספציפי למקדם ו / או העברה מאמצת של תאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית של שני פוטונים מאפשר מחקר דינמי של תאים בודדים בסביבתם הפיזיולוגית. הקבוצה שלנו פיתחה טכניקה לייצוב ריאות עכברים, שאפשרה לנו לדמיין דינמיקה תאית בריאות נאיביות ושתלי ריאות מושתלים אורתוטופית. טכניקה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התנהגות התא בתוך כלי הדם ובאינטרסטיציום, כמו גם לבחינת אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים שונות. הליך זה ניתן ללמוד בקלות ולהתאים לחקר מנגנונים חיסוניים המווסתים תגובות דלקתיות וסובלרוגניות לאחר השתלת ריאות. זה יכול גם להיות מורחב לחקר של תנאים ריאתיים פתוגניים אחרים.

Introduction

השתלת ריאות היא האפשרות האחרונה עבור חולים רבים הסובלים ממחלת ריאות סופנית; עם זאת, הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות היא גרועה בהשוואה להשתלות איברים מוצקים אחרות. הישרדות בגיל 5 שנים היא רק ~ 60%-70%¹, לעומת 80%-90% בלב² ו 85%-90% בכליות³. סיבוכים רבים לאחר השתלת ריאות, כגון תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה בתיווך נוגדנים ותפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה, נובעים מהתגובה החיסונית של המאכסן לאלוגרפט. לדוגמה, הקבוצה שלנו הראתה כי נויטרופילים מגויסים במהירות לתוך אלוגרפט הריאה בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כתוצאה מהשתלה ויוצרים אשכולות דינמיים סביב מונוציטים^{בדם 4}. יחסי גומלין בין תאי התורם והמקבל אחראים לתגובות אלואימוניות מזיקות ^5,6,7, והיכולת לחקור אינטראקציות תאים דינמיות אלה במודל של בעלי חיים חיים לא תסולא בפז.

מיקרוסקופ שני פוטונים מאפשר הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם הלבנה מינימלית של רקמות ^8,9. הוא משמש במגוון רקמות ואתרים אנטומיים, כולל ניאוקורטקס^10,11, עור^12,13 וכליה^14,15. לאחרונה, הוא הותאם לאיברים לא סטטיים כגון הריאה והלב ^4,16,17. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקה לצילום השתלות ריאה מיוצבות, מונשמות ומחוררות לאחר השתלת ריאה אורתוטופית מורין שמאלית. יתרון מרכזי של מודל ההשתלה הוא היכולת לבצע מניפולציה גנטית בין התורם למקבל בנפרד. ניתן לדמיין אוכלוסיות תאים בודדות עם זני עכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי, העברה מאמצת של תאים המסומנים בפלואורסצנטיות⁵, או הזרקה תוך ורידית של נוגדנים המסומנים בפלואורסצנטיות כדי לקשור סמנים ספציפיים לתא 4,16,17,18.

על מנת לייצב את הריאה במהלך ההדמיה, פרוטוקול זה כולל הדבקת הריאה לזכוכית כיסוי, בעוד שקבוצות אחרות תיארו ייצוב יניקה באמצעות מכשיר ואקום הפיך בהתאמה אישית¹⁹. לפרוטוקול שלנו מספר יתרונות, כולל שטח הדמיה גדול יותר וקלות התקנה יחסית באמצעות חומרים זמינים בדרך כלל במעבדת מיקרוסקופיה (כולל זכוכית כיסוי ודבק). מכיוון שטכניקת הדבקה זו מגבילה את הריאה במשטח העליון, היא צפויה להפחית את תנועת האוורור ולאפשר הדמיה עמוקה יותר. טכניקת הדמיה תוך-חיונית זו מאפשרת תצפית מפורטת על התנהגות תאי מערכת החיסון ואינטראקציות בזמן אמת, מה שתורם לחקר מנגנוני החיסון המווסתים תגובות דלקתיות לעומת סובלרוגניות לאחר השתלת ריאות.

Protocol

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

1. הרדמה ואינטובציה

הערה: מבוצעת השתלת ריאה שמאלית אורתוטופית של עכבר, כפי שתואר קודם לכן^20,21. ריאות מעכברי C57BL/6 (B6) במשקל 20-25 גרם מושתלות במקבלי B6 תואמי מין וגיל. ב6. עכברי כתב LysM-GFP משמשים כמושתלים לניסויים נבחרים כדי לדמיין חדירת נויטרופילים לתוך שתלי ריאה. ניתן לצלם עכברים מושתלים מיד לאחר השתלת ריאה.

1. מרדימים מחדש עכברים עם מתן intraperitoneal של קטמין (80-100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (8-10 מ"ג / ק"ג). מתן בופרנורפין בשחרור מושהה (0.5-1.0 מ"ג/ק"ג) תת עורית לשליטה נוספת בכאב. ודא עומק הרדמה מספיק עם צביטת כפה.
   הערה: אם הזמן בין השתלת ריאות לבין הדמיה תוך חיונית מתוכננת הוא פחות משעתיים, ניתן לקחת מינון חוזר של חומר הרדמה עם 50% מהמינון הראשוני של קטמין.
2. הסר את השיער מכל החזה השמאלי באמצעות קוצץ חשמלי ונגב את החזה כדי להסיר את השערות הקצוצות העודפות.
3. החל משחה אופתלמית לא תרופתית על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות הקרנית.
4. בצע אינטובציה מחדש של העכבר עם אנגיוקטטר 20 גרם, כפי שתואר קודם לכן²¹.
5. יש לאוורר עם אוויר בחדר בקצב של 120 נשימות לדקה ונפח גאות ושפל של 0.5 סמ"ק.
6. לספק 1% isofluorane endotracheally במהלך כל ההליך.
7. כדי להמחיש כלי דם במהלך ההדמיה, יש להזריק 20 μL של 655 ננומטר נקודות קוונטיות לא ממוקדות (q-dots) ב-50 μL של מלח חוצץ פוספט תוך ורידי לפחות 5 דקות לפני ההדמיה.

2. הכנה כירורגית של ריאה שמאלית להדמיה

1. הניחו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צידית ימנית (ראו איור 1A).
2. יש לחטא את עור החזה בתערובת של 0.75% יוד ו-70% אתנול, שלוש פעמים.
3. פתחו מחדש את בית החזה השמאלי (מהשתלת ריאות בעכבר) דרך החלל הבין-קוסטלי השלישי (ראו איור 1A).
4. הסירו חלק מהעור ומהרקמה הרכה מעל אתר בית החזה השמאלי, בגודל 1.5X1.5 ס"מ (ראו איור 1B).
5. לפני כריתת הצלעות, תחילה הדקו את הצלעות במשך ~10 שניות כדי לפקפק כל כלי דם כדי להשיג המוסטזיס (ראו איור 1C, D).
6. חתכו חלקים של הצלעות^ה-3 עד^ה-5 כדי ליצור חלון הדמיה גדול מספיק כדי לחלץ את הריאה (~0.8 ס"מ גולגולתית ו~1.0 ס"מ קדמית, איור 1D, E).
7. עצור כל דימום נוסף משולי הצלעות עם electrocautery.
   הערה: זה קריטי כדי להשיג hemostasis בקצה לחתוך של הצלעות כדי למנוע איבוד דם מוגזם במהלך תקופת ההדמיה.
8. הניחו בליטה קטנה (גזה בגודל 4X4 ס"מ מקופלת לאורכה 3 פעמים) מתחת לחזה הימני (ראו איור 1E).
9. בעזרת מקלוני צמר גפן, הרימו את שתל הריאה אל מחוץ לחזה והניחו את החלק התחתון של הריאה על רצועה בגודל 1X3 ס"מ של גזה ספוגה במי מלח (ראו איור 1F).
   הערה: רצועה זו של גזה ספוגה במי מלח מונעת החלקה של הריאה, שומרת על סביבה לחה עבור הריאה, מגנה על הריאה מפני הקצוות החדים של הצלעות המנותחות, ומפרידה את הריאה מתנועת הלב. לאחר יישום תא הדימות ההיקפי על הריאה (איור 1G, H, המתואר בסעיף 3), אמור להיות אובדן מינימלי של חום ונוזלים מחלל בית החזה הפתוח במהלך תקופת ההדמיה.

3. הכנת תא הדמיה

הערה: תא הדמיה בנוי בהתאמה אישית (ראה איור 2A). תא הדמיה זה מורכב מלוח בסיס ולוח עליון שביניהם העכבר ממוקם ומאובטח במקומו באמצעות ברגים טעונים קפיץ משני הצדדים (איור 2B). הלוח העליון מכיל מגרעת עגולה בקוטר ~ 2 ס"מ. טבעת O שחורה בגודל מתאים ממוקמת בפתח הזה בצד הקדמי של הלוח העליון, אשר תגן על עדשת המטרה (איור 2C). זכוכית כיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ מודבקת לחלק האחורי של הצלחת העליונה באמצעות שומן ואקום גבוה, אשר ייצור אטם אטום למים. זכוכית כיסוי זו תשמש כחלון הדמיה על ידי היצמדות לריאה שמתחתיה והחזקת אמצעי ההדמיה (כלומר, מים) מעל. ודא שלא נכנס שומן ואקום לחלון ההדמיה המעגלי. זכוכית הכיסוי תוחלף בכל ניסוי הדמיה חדש. לוח הבסיס מחומם לטמפרטורה של 35-37 מעלות צלזיוס באמצעות בדיקת טמפרטורה תרמית (איור 2A).

1. הניחו את העכבר עם האינטובציה על לוח הבסיס של תא ההדמיה כשהחזה השמאלי הפתוח פונה כלפי מעלה (ראו איור 1G, H). הדקו את העכבר בעזרת סרט משי על הפנים, הכפות הקדמיות והזנב (ראו איור 1H ואיור 2A).
2. מרחו דבק על הצד התחתון של זכוכית הכיסוי המחוברת ללוח העליון (עיגול אפור באיור 2C, למטה), והשאירו עיגול ללא דבק של 0.8-1.0 ס"מ במרכז.
   הערה: יש פשרה בין גודל העיגול נטול הדבק לבין כמות חפץ התנועה; לכן, מומלץ כי המעגל לא יעלה על 1.0 ס"מ קוטר.
3. הנמיכו את הפלטה העליונה עד שזכוכית הכיסוי תיצור מגע עם הריאה, כשהדבק נוגע בפני השטח של הריאה (ראו איור 1G).
   הערה: הריאה השמאלית תודבק לזכוכית הכיסוי עם עיגול נקי ללא דבק באמצע, שהוא האזור שיצולם.
4. החזיקו את זכוכית הכיסוי כנגד הריאה וניפחו את הריאה למשך 1-2 שניות כך שאזור הדבק יידבק לרקמה שמסביב. השג ניפוח ריאות על ידי חסימת צינורות הזרימה מהצינור האנדוטרכאלי של העכבר למכונת ההנשמה.
   הערה: אין לנפח את הריאה למשך יותר מ-1-2 שניות, מכיוון שהדבר עלול לגרום לברוטראומה מוגזמת.
5. יש לסגת מעט מהצלחת העליונה כדי להפחית את הלחץ על רקמת הריאה. ודא שאזור הריאה בחלון ההדמיה אינו זז עם אוורור.
6. אבטחו את שני הקצוות של הלוח העליון על-ידי אבטחת אום האגודל מעל כל בורג (ראו איור 2B).

4. הדמיה של שני פוטונים

הערה: יש להשתמש במיקרוסקופ זקוף בעל שלב קבוע עם יעד טבילה במים של 20x או 25x >1.0 (NA) עבור מיקרוסקופ תוך חיוני. להלן ההגדרה ששימשה במחקר זה עבור B6 עד B6. LysM-GFP השתלת ריאה שמאלית עם תיוג כלי דם q-dot 655-nm. בעת יישום פרוטוקול זה, ניתן להתאים את ההתקנה של המיקרוסקופ, הלייזרים והמסננים הדיכרואיים בהתבסס על הצרכים של הניסוי הספציפי והכתבים הפלואורסצנטיים שבהם נעשה שימוש.

1. הניחו את כל תא ההדמיה עם העכבר המושתל שעבר אינטובציה (ריאה שמאלית B6 מושתלת ב-B6. LysM-GFP עם נקודות q-dot של 655 ננומטר) על במת המיקרוסקופ (ראו איור 2A).
2. השתמשו במסננים דיכרואיים באורכי גל של 480 ננומטר, 560 ננומטר ו-635 ננומטר, אשר יפרידו כראוי את האותות ממדווח GFP, נקודות q, ואות הדור ההרמוני השני (SHG) (445 ננומטר) שנוצר על ידי קולגן. ניתן להתאים מסננים אלה בהתאם לניסוי הספציפי.
   הערה: אות SHG שנוצר על-ידי קולגן תוחם מבנים דמויי מכתש כהה, המייצגים מרחבי אוויר בנאדיות (ראו חיצים לבנים באיור 3).
3. הגדר את הלייזר פמטו-שנייה עם פמפונת טיטניום-ספיר ל-890 ננומטר (בטווח האינפרא-אדום הקרוב) לעירור. השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית כדי להשיג אות מספיק.
   הערה: יש להתאים את הגדרות הלייזר לניסוי הספציפי כדי למקסם את הפרדת האותות.
4. מרחו ~1 מ"ל מים כדי לכסות לחלוטין את זכוכית הכיסוי בצלחת העליונה, שתישמר במקומה על-ידי טבעת ה-O ואטם השומן בוואקום של זכוכית הכיסוי לצלחת העליונה (ראו איור 1G ואיור 2C).
5. השתמש במטרה טבילה במים 20x >1.0 NA במיקרוסקופ. ודא שהעדשה האובייקטיבית מותאמת בהתאם לניסוי הספציפי.
   הערה: NA גדול יותר מאפשר איסוף אור רב יותר, ניגודיות גבוהה יותר ותמונות מפורטות יותר. מטרות טבילה במים עדיפות מכיוון שמים או חיץ מתאימים יותר לרקמות ביולוגיות.
6. הנמיכו את מטרת המיקרוסקופ למים והתמקדו בפני השטח של הריאה.
7. הפעל את מחמם צלחת הבסיס ולשמור על הטמפרטורה ב 35-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: אם יש חששות לגבי חוסר היכולת לשמור על טמפרטורת הרקמה או זילוח מספיק לריאה, ניתן לחבר שני נגדים נוספים כדי לחמם את הצלחת העליונה בנוסף לצלחת הבסיס (ראה איור משלים 1).
8. רכוש ערימות תמונות עם תוכנת רכישה לפי בחירה.
   הערה: ודא שהחדר חשוך לחלוטין במהלך הרכישה, דבר שעשוי לכלול שימוש בווילונות האפלה / תריסים וכיסוי אסטרטגי של כל מקורות האור.

5. רכישת וידאו

הערה: ניתן להתאים את הפרמטרים הבאים בהתבסס על הניסוי הספציפי. שלבים 5.1-5.3 מתארים את הפרמטרים הספציפיים המשמשים עבור B6 עד B6. Lysm-GFP murine השתלת ריאה שמאלית, אשר יכול לשמש כמדריך התייחסות.

1. באמצעות סורק דו-כיווני בקצב וידאו, הגדר את מידות סריקת x-y ל- 512 x 512 פיקסלים.
2. באמצעות יחידת צעד xyz, השג הקלטות קיטועי זמן של מחסנית z בת 21 שלבים עם ממוצע של 10 פריימים לכל צעד. כל ערימה אורכת כ-20 שניות, הכוללת את הזמן הדרוש לממוצע פריימים, מנוע הצעד לזוז ולבדוק את מיקומו, והשהיה של 100 אלפיות השנייה.
   הערה: הסורק הדו-כיווני במיקרוסקופ ששימש במחקר זה פועל בקצב וידאו של 30 פריימים לשנייה. זה עשוי להשתנות בהתאם להגדרת המיקרוסקופ הספציפי.
3. רכוש 80 ערימות z רצופות כדי לקבל הדמיה בהילוך מהיר של נדידת לויקוציטים בתוך פרנכימת הרקמה. זה לוקח בערך ~ 27 דקות ב 20 s / stack.
   הערה: יש למזער את גודל הערימה, ממוצע הפריימים, עוצמת הלייזר והאורך הכולל של הקלטת קיטועי הזמן כדי למנוע חשיפה מוגזמת של לייזר לרקמה. אם כתבים פלואורסצנטיים המשמשים הם בהירים (כלומר, GFP) ועוצמת הלייזר נמוכה, אז חזרה על מחסנית z של 21 שלבים עם ממוצע של 10 פריימים, סריקה של 512 x 512 פיקסלים, במרווחים של 20 שניות למשך ~ 27 דקות נסבלת היטב על ידי העכבר. אם יש צורך בפרקי זמן ארוכים יותר של הדמיה, יש להגדיל את זמן הרכישה לכל ערימה כדי לשמור על חשיפת הלייזר הכוללת זהה (כלומר, דקה אחת לכל ערימה מעל ~1.5 שעות). יהיה צורך למטב הגדרות אלה בהתבסס על כתבי הפלואורסצנט שבהם נעשה שימוש.
4. הרדימו את העכבר בסוף רכישת התמונה. כדי להרדים את העכבר עם קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (8-10 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן נקע צוואר הרחם. תכשירי הדמיה טיפוסיים ישמרו בקלות על יכולת הקיום של העכבר למשך עד שעתיים.
   הערה: כדי להאריך תקופה זו, ייתכן שיהיה צורך בתוספת נוזלים נוספת, הרדמה עם איזופלורן ותשומת לב לוויסות הטמפרטורה.
5. עיבוד וידאו מלא עם Imaris. ניתן להשתמש גם בתוכנות הדמיה אחרות (כגון ImageJ).
   הערה: ניתן לעבד תמונות לאחר הרכישה באמצעות שיפור ניגודיות, החלקה ואריתמטיקה של ערוצים כדי להסיר crosstalk של ערוצים.

תוצאות

לאחר שעה של אחסון איסכמי קר בטמפרטורה של 4°C, השתלנו אורתוטופית את הריאה השמאלית מעכבר B6 לתוך B6. עכבר LysM-GFP⁴, ולאחר מכן בוצעה הדמיה תוך חיונית של שני פוטונים, כמתואר לעיל. ביצענו הדמיה בשתי נקודות זמן לאחר ההשתלה – שעתיים (איור 3A) ו-24 שעות (

Discussion

עירור שני פוטונים תואר לראשונה בעבודת הדוקטורט שלה על ידי מריה גפרט-מאייר בשנת 1931, שזכתה מאוחר יותר בפרס נובל לפיזיקה על תיאור מבנה המעטפת הגרעינית^22,23. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי מסתמך על עירור פוטון יחיד, עם אורכי גל עירור קצרים ובעלי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control