JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

Abstract

אורגנואידים בקליפת המוח האנושית הפכו לכלים חשובים לחקר התפתחות המוח האנושי, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה של המוח האנושי. מחקרים שניתחו את תפקוד הגנים על ידי ביטוי יתר או נוקאאוט סייעו במודלים של בעלי חיים לספק תובנות מכניסטיות לגבי ויסות התפתחות הניאוקורטקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לנוקאאוט גנטי חריף בתיווך CRISPR/Cas9 על ידי אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים. חיתוך אורגנואידים בקליפת המוח מסייע בזיהוי מבנים דמויי חדרים להזרקה והתחשמלות לאחר מכן, מה שהופך אותו למודל מתאים במיוחד למניפולציה גנטית חריפה במהלך התפתחות קליפת המוח האנושית. אנו מתארים את התכנון של רנ"א מנחה ואת התיקוף של יעילות מיקוד במבחנה ובאורגנואידים בקליפת המוח. אלקטרופורציה של אורגנואידים בקליפת המוח מבוצעת בשלבים נוירוגניים בינוניים, ומאפשרת מיקוד של רוב סוגי התאים העיקריים בניאוקורטקס המתפתח, כולל גליה רדיאלית אפיקלית, תאי אב בסיסיים ונוירונים. יחד, אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים מייצגת טכניקה רבת עוצמה לחקר תפקוד גנים, בקרת גנים ומורפולוגיה של התא במהלך התפתחות קליפת המוח.

Introduction

הניאוקורטקס מתייחס לכיסוי החיצוני של חצאי המוח והוא מבנה ייחודי ליונקים. הניאו-קורטקס מייצג את מושבם של תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר 1,2,3,4,5. במהלך ההתפתחות, תאי גזע עצביים ותאי אב מעוררים נוירונים בתהליך הנקרא נוירוגנזה. מחקרים פונקציונליים החוקרים את התפתחות הניאו-קורטקס האנושי מספקים את הבסיס להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות תאי גזע עצביים אנושיים, פתולוגיות עצביות ואבולוציה של המוח האנושי 2,6,7.

מבחינה היסטורית, מחקרים על התפתחות המוח האנושי הסתמכו על גישות היסטולוגיות תיאוריות המשתמשות ברקמה שלאחר המוות, כאשר מערכות תרביות רקמה צפות חופשיות עדכניות יותר אפשרו חקירות תפקודיות עם רקמת עובר אנושית 8,9. בנוסף, רקמת מוח עוברית אנושית הוכחה כבעלת יכולת להתארגן בעצמה לאורגנואידים מתרחבים לטווח ארוך10. מחקר רקמות עובריות סיפק תובנות חשובות על התפתחות האדם11,12, אך זמינות רקמות מוגבלת ושיקולים אתיים מגבילים את יישומו הנרחב למחקרים מכניסטיים של התפתחות המוח האנושי. בעשור האחרון פותחו פרוטוקולים המאפשרים יצירה של אורגנואידים עצביים תלת-ממדיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), כולל PSC המושרה על ידי בני אדם (hiPSC)13,14.

אורגנואידים מוחיים מציגים תכונות חשובות של המוח המתפתח, כגון היווצרות מבנים דמויי חדרים, קוטביות אפיקובסאלית, ציטוארכיטקטורה קליפת המוח, הגירה גרעינית אינטרקינטית במהלך חלוקת גליה רדיאלית, והגירה עצבית. חשוב לציין, מודלים אורגנואידים אנושיים חדשים אלה משחזרים מאפיינים של המוח האנושי המתפתח שאינם מעוצבים היטב בעכבר, כולל סוגי אבות עצביים מרכזיים רלוונטיים מבחינה אבולוציונית, במיוחד גליה רדיאלית בסיסית (או גליה רדיאלית חיצונית)7,14,15. מספר מגבלות של פרוטוקולים מוקדמים של אורגנואידים מוחיים - כגון בעיות עם הטרוגניות אורגנואידים, אספקת מזון מוגבלת לליבה הפנימית וזהות אזורית מגוונת - טופלו בהתקדמות הפרוטוקולים האחרונים וניתן לצפות לשיפורים נוספים בשנים הקרובות 15,16,17,18,19. אורגנואידים מוחיים וקליפת המוח האנושיים הפכו במהירות למודלים מרכזיים לחקר התפתחות קליפת המוח האנושית20, הפרעות נוירולוגיות 21,22,23,24 והתפתחות המוח 25,26,27,28,29, ולביצוע גישות סינון בקנה מידה גדול 30,31,32.

עבור מניפולציה גנטית חריפה, שתי שיטות שימשו בעיקר במודלים של בעלי חיים של התפתחות ניאוקורטקס: משלוח ויראלי על ידי זיהום של תאי מטרה33 וברחם או אלקטרופורציה חוץ גופית 34,35. הזרקת DNA - ולאחרונה, CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) קומפלקסים36- לתוך החדרים הצדיים, ואחריו אלקטרופורציה, מספקת את היתרון כי אזורים מסוימים במוח ניתן לכוון על בסיס הכיוון של אלקטרודות אלקטרופורציה. אלקטרופורציה כרוכה בפולסים חשמליים קצרים המגבירים באופן זמני את חדירות קרום התא, ומאפשרים החדרת DNA ומולקולות טעונות אחרות לתאים. ברחם אלקטרופורציה בוצעה לראשונה בעכבר37, שם היא הפכה במהירות למתודולוגיה מיושמת באופן נרחב עבור נוירוביולוגיה התפתחותית. השיטה יושמה לאחר מכן גם על מינים אחרים, כגון חולדה38,39 וחמוס 40,41,42, מין גירנצפלי המשמש לחקר התפשטות ניאו-קורטקס וקיפול קליפת המוח 3,43,44,45.

אלקטרופורציה הפכה גם לשיטה חשובה במחקר אורגנואידים במוח האנושי46. באורגנואידים מוחיים, אלקטרופורציה יושמה כדי להמחיש מורפולוגיה של התא ואקסונים עצביים14,47, כדי לספק ריאגנטים להפלה של גנים 22,48,49, וכדי לחקור את תפקוד הגנים על ידי ביטוי יתר 50. השיטה אינה מוגבלת למודלים אנושיים אלא יושמה גם עבור שינוי גנטי של אורגנואידים מוחיים פרימטים50,51. יתר על כן, אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים שנוצרו בביוריאקטור מסתובב ספין Ω תוארה52.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים15 עבור מחקרים על תפקוד גנים בהתפתחות קליפת המוח. אורגנואידים ספציפיים לאזור המוח מגבירים את יכולת השחזור והעקביות, שהם קריטיים להצלחת ניתוח כמותי, למשל, במידול מחלות. בפרוטוקול15 של אורגנואיד קליפת המוח האנושית החתוכה, רמזי דפוס חזקים מיושמים במהלך התמיינות iPSC כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית של אבות המוח הקדמי הגבי, ואחריה יישום של מדיה תרבית המקדמת צמיחת רקמות עם פחות אותות מאלפים 53,54. הוכח כי חיתוך אורגנואידים בקליפת המוח מפחית מוות תאי כתוצאה מזמינות מופחתת של חומרים מזינים וחמצן בליבת האורגנואיד15. יתר על כן, חיתוך תומך בהתפתחות של מבנים דמויי חדרים המכילים גליה רדיאלית בסיסית שופעת, עם נוירוגנזה מתמשכת המובילה להיווצרות אזור דמוי צלחת קליפת המוח מורחבת15. החיתוך החוזר בפרוטוקול זה גם הופך את האורגנואידים קליפת המוח הללו למתאימים במיוחד להתחשמלות, מכיוון שניתן לזהות בקלות את לומן החדר ולכוון אותו באמצעות הזרקה. אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים פרוסים יושמה לחקר אזורי בקרת גנים ואבולוציה קליפת המוח26,55.

במהלך הליך electroporation, תערובת ההזרקה מועברת לומן של מבנים דמויי חדר. עם הפעלת שדה חשמלי פועם, התערובת נלקחת על ידי גליה רדיאלית אפית המרפדת את החדר. כאשר גליה רדיאלית אפית מתחלקת ויוצרת סוגי תאים מחויבים יותר4, החומרים המתחשמלים מועברים לתאי אב בסיסיים ולנוירונים. צאצאים אלקטרופורטיים מופצים באזור החדר (VZ) ובאזור התת-חדרי (SVZ) לאחר 3 ימים ומשתרעים על פני רוב דופן קליפת המוח, כולל האזור דמוי הצלחת הקורטיקלית (CP), 7 ימים לאחר אלקטרופורציה במהלך שלבים נוירוגניים בינוניים26,55.

כאן, אנו מתארים שיבוש גנטי בתיווך CRISPR/Cas956 על ידי אלקטרופורציה באורגנואידים קליפת המוח האנושית פרוסה26. בנוסף, שיטת האלקטרופורציה יכולה להיות מיושמת גם עבור ביטוי יתר של גנים, ויזואליזציה של מורפולוגיה של התא ותהליכים תאיים על ידי ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים, מסירת ספריות פלסמיד עבור Massive Parallel Reporter Assays (MPRA), אספקת כלי עריכה אפיגנום ותיוג תאים להדמיה חיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים המערבים תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) בוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים שתוארו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית של בית החולים האוניברסיטאי דרזדן (IRB00001473; IORG0001076; מספר אישור אתי SR-EK-456092021).

1. תכנון RNA מנחה לנוקאאוט גנטי חריף בתיווך CRISPR/Cas9

  1. תכנן זוג רנ"א מנחה (gRNAs) המכוון לאותו אקסון עם מרחק אידיאלי של 7-11 bp (הימנעות מכפלות של 3 bp) בין מוטיבים סמוכים של פרוטוספייסר (PAMs) כדי להגדיל את הסבירות לשיבוש חלבונים באמצעות תוכנה או כלים מקוונים.
    הערה: באופן אידיאלי, אקסונים המקודדים תחומים פונקציונליים צריכים להיות ממוקדים. לחלופין, ניתן לבחור את האקסונים הראשונים של התמליל (איור 1A). בחר את הרנ"א המדריך בהתבסס על ציון פעילות (קרוב ל-1)57 וציון ספציפיות (קרוב ל-100%)58.

2. תרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

  1. כדי ליצור אורגנואידים בקליפת המוח האנושית ולאמת את תפקוד gRNA, השתמש בקו hiPSC CRTDi004-A59 הנגזר מתורם בריא.
  2. תרבית את iPSCs כפי שתואר קודם לכן60 על מטריצת קרום הבסיס מצופה 6-well לוחות בתווך תאי גזע בתנאים סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO2). PSCs מושרים צריכים לעבור במפגש של 80% באמצעות אנזים לדיסוציאציה של תא בודד עם תוספת של מעכב מסלול ROCK (1:1,000) במהלך 24 השעות הראשונות.
    הערה: קווי iPSC אחרים עשויים לשמש לייצור אורגנואידים ולאימות gRNA.

3. מיצוי DNA גנומי מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

  1. השתמש 2 בארות של 80%-90% hiPSC מפגש של צלחת 6 בארות עבור מיצוי DNA גנומי. נתקו את התאים מהצלחת בעזרת אנזים כדי ליצור השעיה חד-תאית. קח את התאים ב 1 מ"ל של תווך תאי גזע (נפח כולל), ולאחר מכן להסתובב במשך 10 דקות ב 600 x גרם ולהסיר את supernatant.
  2. השהה מחדש את גלולת התא ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזיס (50 מילימטר TrisHCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.5% SDS, 5 mM EDTA ב-H2O) ו-12.5 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל מלאי). יש לדגור במשך שעתיים ב-55°C וב-250 סל"ד.
  3. מערבבים פנימה 100 μL של 5 mM NaCl. סחרור במשך 10 דקות ב- 18,000 x גרם ב- 4 ° C והעבר את הסופרנאטנט לצינורות תגובה חדשים של 1.5 מ"ל.
  4. הוסף 250 μL של איזופרופנול, הפוך את הצינורות מספר פעמים, וסחרור במשך 15 דקות ב 18,000 x גרם ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant, לשטוף עם 500 μL של 70% EtOH (כיתה ביולוגיה מולקולרית), להפוך את הצינורות, ולסובב במשך 10 דקות ב 18,000 x גרם ב 4 ° C.
  6. לבסוף, הסר לחלוטין את הסופרנאטנט על ידי הרחקתו בזהירות ולחץ על צינורות התגובה הפתוחים על מגבות נייר.
  7. תן לגלולה להתייבש באוויר במשך 10 דקות ב- RT, ואז להמיס את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז למשך 30 דקות ב -37 מעלות צלזיוס.
  8. למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרומטר. DNA גנומי מבודד יציב ב -20 ° C במשך מספר חודשים.

4. אימות זיהוי תבנית על ידי gRNA (in vitro)

הערה: כגישה הראשונה לאימות זיהוי תבניות מוצלח על ידי gRNAs, בצע תגובת Cas9 במבחנה שבה DNA דו-גדילי נחתך לשני מקטעים שניתן להבחין ביניהם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 40,61,62.

  1. כדי ליצור את התבנית, בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה ופריימרים של 10 מיקרומטר על DNA גנומי שבודד מ- hiPSC (סעיף 3) באמצעות תנאי המחזור הבאים: דנטורציה ראשונית ב- 98 ° C למשך 30 שניות, 40 מחזורים [98 ° C, 10 שניות; 60 ° C, 30 שניות; 72 ° C, דקה אחת] והתארכות סופית ב 72 ° C למשך 5 דקות.
    1. התאימו את טמפרטורת החישול בהתאם לפריימרים של PCR. ודא שגודל האמפליקון הוא 800 bp עד 1.5 kb עם לוקליזציה אסימטרית של אתרי הקישור gRNA.
    2. לפתור את המוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל על ג'ל agarose 1.5%, לחתוך את הרצועה המתאימה מן הג'ל לחלץ את DNA26.
    3. למדוד את ריכוז ה- DNA של מוצר ה- PCR שחולץ באמצעות ספקטרומטר.
  2. הרכיבו את ה-gRNA הפונקציונלי על ידי שילוב של 10 מיקרומטר של CRISPR RNA (crRNA, רצף מותאם אישית, מלאי של 100 מיקרומטר) ו-10 μM tracrRNA (מלאי של 100 מיקרומטר) במאגר דופלקס נטול נוקלאז (נפח כולל של 5 מיקרוליטר). דגרו על התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורה של 95°C, ולאחר מכן הניחו לה להתקרר לטמפרטורת החדר (RT).
  3. צור את קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) על ידי שילוב של 10 מיקרומטר של gRNA משלב 4.2 ואנזים Cas9 1 μM ( מסטרפטוקוקוס פיוגנס, 62 מיקרומטר מלאי) ב- PBS למשך 15 דקות ב- RT (נפח כולל של 25 מיקרוליטר).
  4. כדי לבצע את תגובת העיכול במבחנה , ערבבו 1 מיקרומטר של קומפלקס RNP (משלב 4.3) עם תבנית DNA של 0.1 מיקרומטר (מוצר PCR משלב 4.1) ומאגר תגובת נוקלאז Cas9 1x (המכיל 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6.5; ניתן לאחסן ב- aliquots ב -20 °C).
    1. מלאו עד נפח סופי של 10 μL במים נטולי נוקלאז.
    2. לדגור את התגובה ב 37 ° C במשך 1 שעות.
    3. הוסף 2 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K ודגור במשך 10 דקות נוספות ב 56 ° C כדי לשחרר את מצע ה- DNA מהאנזים Cas9. אחסנו את תערובת התגובה המעוכלת בטמפרטורה של 4°C או -20°C עד לניתוח הסופי.
      הערה: מומלץ להשתמש ביחס מולארי של 10:1 של מצע Cas9-RNP:DNA כדי להשיג את יעילות המחשוף הטובה ביותר. יש לדלל את מוצר ה-PCR במים נטולי נוקלאז לריכוז הנדרש, במידת הצורך. כבקרה שלילית, ניתן לקחת תערובת תגובה החסרה את האנזים gRNA או Cas9.
  5. דמיינו מוצרים שסועים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז על ג'ל אגרוז 2%.
    הערה: באופן אידיאלי, שני פסים בגודל שונה אמורים להיות גלויים, ורצועת התבניות הייתה אמורה להיעלם או להיות מופחתת מאוד עבור gRNA יעיל (איור 1B).

5. אימות תפקוד gRNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

הערה: מומלץ לבדוק את היעילות של gRNA המכוון לאותו קו תאים שממנו יופקו אורגנואידים קליפת המוח26. לשם כך, קומפלקסים של RNP המכילים את ה-gRNA הרלוונטי מועתקים יחד עם פלסמיד ביטוי GFP לתוך hiPSCs, התאים מתורבתים במשך 3 ימים, ו- DNA גנומי מבודד לאחר מכן לניתוח ריצוף. עבור כל בדיקת gRNA נדרשים כ-200,000 תאים. התאים לא צריכים להיות יותר מ-70%-80% חופפים והיו צריכים לעבור לפחות פעמיים לאחר ההפשרה. חשוב לקחת בקרה שלילית (gLACZ)36,63 ומצב מדומה (תמיסת נוקלאופקציה ללא RNP).

  1. שנו את התווך של hiPSC כך שיכלול מעכב ROCK (1:1,000) שעתיים לפני הניסוי כדי להגדיל את הכדאיות של התאים בתרבית תאים.
  2. מצפים את המספר המתאים של בארות של צלחת 6 בארות עם מטריצה קרום בסיסי.
  3. הפעל את יחידת הנוקלאופקטור ("יחידת X" עבור רצועות 16 בארות) ובחר את התוכנית "תאי ES, H9" כפי שתוכנתה מראש (דופק CB150). בחר את המספר המתאים של בארות של הרצועה.
  4. הכן את מתחמי ה-RNP על-ידי שילוב של 24 μM crRNA ו-24 μM tracrRNA ב-Duplex Buffer.
    1. יש לדגור בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן לתת להתקרר ל-RT, כמתואר בשלב 4.2.
    2. בינתיים, לדלל את האנזים Cas9 ל 8 מיקרומטר ב PBS.
    3. ערבבו 3 μL של gRNA ו-3 μL של Cas9, ודגרו 15 דקות ב-RT כדי להרכיב את ה-RNP.
      הערה: יחס מולארי של 3:1 gRNA:Cas9 מעניק יעילות מחשוף אופטימלית. כדי לבדוק gRNA כזוג, להכין כל RNP בנפרד ולשלב 1.5 μL של כל RNP בסוף.
  5. במהלך דגירה של 15 דקות RNP, הכינו את hiPSC לנוקלאופקציה מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים.
    1. החליפו את ציפוי קרום הבסיס ב-1.5 מ"ל של תווך תאי גזע בתוספת מעכב ROCK (1:1,000) ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין לכל באר.
    2. הכן את תמיסת הנוקלאופקציה כתערובת אב על קרח בהתאם להוראות היצרן.
    3. נתקו את תאי ה-HiPSC מהצלחת כדי ליצור תרחיף של תא בודד (כמתואר בסעיף 2) וספרו את התאים עם צביעת Trypan Blue בתא ספירה של נויבאואר.
    4. גלולה 200,000 תאים חיים לכל זוג gRNA ב 600 x גרם במשך 5 דקות.
  6. בתרבית התא, על קרח, להוסיף 3 μL של RNP ל 20 μL של תמיסת nucleofection בתוספת 0.2 μg / μL pCAG-GFP פלסמיד.
  7. מרחפים מחדש את התאים הכדוריים ב-23 מיקרוליטר של תערובת הנוקלאופקציה הסופית ומעבירים אותם לבאר אחת של רצועת נוקלאופקציה בת 16 בארות על קרח.
  8. לאחר שכל התנאים נמצאים ברצועה, מקם אותה במכונת הנוקלאופקטור יחידת X מחוץ למכסה המנוע ולחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את הגרעין.
  9. לאחר מכן, העבירו את רצועת הנוקלאופקציה חזרה מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים והעבירו תאים נוקלאופקטיבים לצלחת 6 בארות מוכנה על ידי שטיפת בארות הרצועה עם מעט תווך מהצלחת.
  10. תרבית את hiPSC במשך 3 ימים, שינוי מדיום המכיל 1x פניצילין/סטרפטומיצין מדי יום. לאחר 24 שעות, מעכב ROCK אינו נחוץ עוד.
  11. בדקו אם יש אות GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל (איור 1C).
    1. ביום השלישי, מיין ואסוף תאים חיוביים ל-GFP לפי מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS).
    2. הכן את מאגר המיון עם 2% FBS ב- PBS ושמור על 4 ° C.
    3. מצננים צנטריפוגה שולחנית ל-4°C. הכינו צינורות תגובה של 1.5 מ"ל עם חיץ מיון של 50 מיקרוליטר המכיל מעכב ROCK (1:1,000) לאיסוף תאים לאחר FACS על קרח וצינורות פוליסטירן בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל עם מכסי מסננת תאים על קרח.
    4. בצע תרחיפים חד-תאיים של התאים הגרעיניים.
    5. השהה מחדש את התאים ב 1 מ"ל של תווך תאי גזע המכיל מעכב ROCK (1:1,000) לכל דגימה וצנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 5 דקות.
    6. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים ב- 200 μL של מאגר מיון עם מעכב ROCK (1:1,000), ולאחר מכן הוסף 0.4 μL של DAPI (2 ננוגרם/μL) כדי לזהות תאים חיים לפי FACS.
    7. יש לפענח את תמיסת התא דרך מכסה המסננת של הצינורות העגולים והמקוררים כדי להסיר את שאריות גושי התא.
      הערה: DAPI עלול לפגוע בכדאיות התא לאורך זמן, ולכן עדיף להוסיף טרי לכל דגימה לפני המיון.
    8. מיין 10,000 תאים חיים חיים חיוביים ל-GFP (DAPI-negative) לתוך צינורות התגובה של 1.5 מ"ל שהוכנו קודם לכן עם 50 μL של חיץ מיון המכיל מעכב ROCK (על קרח).
  12. לאחר FACS, לחלץ ישירות DNA גנומי מתאים ממוינים.
    1. סובב כלפי מטה את התאים הממוינים שנאספו במאגר המיון במהירות של 600 x גרם למשך 10 דקות.
    2. הסר את supernatant ולקחת את גלולת התא ב 250 μL של חיץ ליזה בתוספת 12.5 μL של פרוטאינאז K לכל דגימה.
    3. המשך כמתואר בסעיף 3.
    4. לבסוף, ממיסים את כדורית הדנ"א ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  13. בצע PCR כדי ליצור תבנית עבור ריצוף Sanger כמתואר בשלב 4.1. כבקרה, השתמש בדנ"א ממצבg LACZ ובפריימרים המכוונים לגן המעניין (אותם פריימרים המשמשים בסעיף 4). מוציאים את הגומיות המתאימות מהאלקטרופורזה של ג'ל האגרוז, מטהרים אותו מעל עמוד ושולחים אותו לריצוף סנגר.
  14. תוצאות ריצוף Sanger של Align Sanger באמצעות יישור גלובלי זוגי.
    הערה: ניתן לזהות מיקוד מוצלח על-ידי אותות על-גבי או רצפים לא שלמים הנובעים מהחדרות/מחיקות אקראיות סביב אתר קשירת ה-gRNA (איור 1D).

6. יצירת אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים

הערה: אורגנואידים בקליפת המוח האנושית (hCO) נוצרים על פי שיטת האורגנואיד הניאוקורטיקלי החתוך (SNO), כפי שתואר קודם לכן בפירוט15,60.

  1. נתק מושבות hiPSC קטנות מבאר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase על ידי דגירה במשך 30-40 דקות ב 37 ° C באינקובטור. בינתיים, מעילים צלחת חדשה 6 בארות עם מטריצת קרום הבסיס.
    1. עצור את האנזים עם 1 מ"ל של תווך תאי גזע ואסוף את המושבות עם קצה רחב ב 5 מ"ל של תווך תאי גזע בצינור חרוטי 15 מ"ל.
      הערה: כל צעד המזכיר "קצוות פיפט רחבים" יכול להתבצע גם עם טיפים חתוכים לפתח בקוטר של לפחות 2 מ"מ.
    2. לאחר שהמושבות התיישבו לתחתית, הסר את המדיום הישן והחלף אותו בתווך תאי גזע טריים.
    3. בעזרת קצה רחב, מפזרים את המושבות באופן שווה על צלחת 6 בארות מצופות עם 1.5 מ"ל של תווך תאי גזע לכל באר.
    4. תרבית את hiPSC במשך 2-3 ימים בתנאים סטנדרטיים.
  2. לאחר שמושבות hiPSC הגיעו לקוטר של כ-1.5 מ"מ, נתקו שוב את כל המושבות עם 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז על ידי דגירה של עד שעה אחת ב-37°C.
    1. עצור את האנזים עם 6 מ"ל של תווך המוח הקדמי 115 ואסוף מושבות מנותקות בצינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות קצוות רחבים.
    2. לאחר שהמושבות התיישבו, הסירו את המדיום הישן ושטפו עם 5 מ"ל של תווך המוח הקדמי 1.
    3. לבסוף, להעביר את המושבות לצלחת חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד המכילה 3 מ"ל של מוח קדמי בינוני 1 לכל באר עם קצוות רחבים ולתת להם ליצור גופים עובריים (EBs). שלב זה מציין את יום 0 של פרוטוקול האורגנואידים בקליפת המוח האנושית. מכאן ואילך, עקוב אחר הפרוטוקול כפי שפורסם15.
  3. ביום השביעי, הטמע EBs במטריצת קרום בסיסית, עם כ -20 EBs לכל "עוגייה" ותרבית במשך שבוע אחד בתווך המוח הקדמי 2 15. ביום ה-14, שחררו באופן מכני אורגנואידים מהמטריצה והמשיכו לגדל בלוחות חיבור אולטרה-נמוכים של 6 בארות בתווך המוח הקדמי 315 על שייקר אורביטלי ב-120 סל"ד.
  4. מהיום ה-35, 1% v/v מטריצת הממברנה הבסיסית מתווספת למדיום.
  5. בשבוע 6, הטמיעו אורגנואידים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 3% וחתכו ויברטומה לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר (איור 2A, B), אשר תומך באספקת חמצן וחומרי מזון בכל האורגנואידים. במידת הצורך, חזור על חיתוך אורגנואידים כל 4 שבועות.
  6. מהיום ה-70, תרבית אורגנואידים במדיום המוח הקדמי 415.

7. אלקטרופורציה של אורגנואידים קליפת המוח האנושית פרוסה

הערה: ניתן להזריק אורגנואידים בקליפת המוח האנושית ולחשמל אותם ברגע שמבנים דמויי חדרים נראים לעין, בערך משבוע 2 ואילך. עבור אורגנואידים בשלב מאוחר יותר (שבוע 5 ומעלה), האלקטרופורציה היא היעילה ביותר ואת הכדאיות של תאים הוא הטוב ביותר כאשר ההליך מבוצע 2 ימים לאחר חיתוך של אורגנואידים26,55. לאחר החיתוך, קל לזהות מבנים דמויי חדרים, מה שמסייע להליך ההזרקה (איור 2C, D). יתר על כן, מבנים דמויי חדרים נשארים פתוחים חלקית זמן מה לאחר החיתוך, ומאפשרים לתמיסת הזרקה עודפת לברוח, מה שמגן על שלמות חגורת הצומת הדבקה המצפה את החדרים. ניתן להזיז את לוח הזמנים של החיתוך כך שיתאים לציר הזמן של הניסוי. יש לחזור על החיתוך כל 3-4 שבועות לתרבויות ארוכות טווח.

  1. משוך את נימי זכוכית בורוסיליקט להזרקות במושך מיקרו-נימי עם ההגדרות הבאות: P 500, חום 600, משיכה 30, מהירות 40, זמן 1. אחסנו את הנימים בצלחת פטרי גדולה בעזרת נייר דבק לקיבוע.
  2. ביום ההתחשמלות, הכינו מחדש את קומפלקס CRISPRR/Cas9 RNP כמתואר בשלב 5.4 עם ריכוז סופי של 24 μM RNP. קו-אלקטרופורציה של פלסמיד pCAG-GFP 0.1 מיקרוגרם/μL (או של כל כתב פלואורסצנטי אחר) תומכת בזיהוי תאים מחושמלים. בנוסף, יש להוסיף תמיסה ירוקה מהירה 0.1% במים לתערובת ההזרקה הסופית, המאפשרת אישור על אספקה מוצלחת של התערובת.
    הערה: הכינו תערובות נפרדות לכל גן מעניין ולבקרת gLACZ .
  3. לחמם מראש את הפתרון של Tyrode (חבילה אחת מלח Tyrode, 1 גרם של NaHCO3, 13 מ"ל של 1 M HEPES pH 7.25 ב 1 L של dH2O) ל 37 ° C. לאחסן את הפתרון של Tyrode הנותרת ב 4 ° C במשך מספר חודשים.
  4. בחרו hCO עם מבנים דמויי חדרים מפותחים היטב (איור 2E) והשליכו אורגנואידים שלא מראים מבנים דמויי חדרים (איור 2F). מעבירים עד 10 אורגנואידים לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה את התמיסה של טירוד ושומרים את שאר ה-hCOs באינקובטור.
  5. ממלאים מיקרו-נימי זכוכית ב-10 מיקרו-ליטר של תמיסת ההזרקה בעזרת קצה פיפטה מיקרו-מעמיס ופותחים את הנימים על ידי צביטת הקצה הדק בפינצטה. בדוק אם הנימים פתוחים על ידי שחרור תערובת הזרקה לתוך הפתרון של Tyrode. בצע את ההזרקות עם מזרק זעיר בסביבה רציפה עם gating מבוקר באמצעות מתג כף הרגל.
  6. הכניסו את הנימים למרכז של מבנים דמויי חדרים (איור 2C) והזריקו 0.2-0.5 μL של התערובת על-ידי לחיצה על מתג כף הרגל.
    הערה: ניתן להזריק עד 5 חדרים לכל hCO עם סך של 7-8 hCOs מעובדים לכל שכפול. באופן אידיאלי, חדרים הפונים לחלק החיצוני של hCO צריכים להיות ממוקדים, מאחר שהם בדרך כלל המפותחים ביותר (איור 2G, H).
  7. השתמש במלקחיים עדינים כדי לדחוף את האורגנואיד נגד כדי להגביל את התנועה. אל תתפסו את האורגנואידים (איור 2C).
  8. לאחר ההזרקה, השתמשו בקצה פיפט רחב כדי להעביר 1-2 אורגנואידים לתוך תא אלקטרופורציה שמכיל את התמיסה של טירוד (איור 2C, D).
  9. כיוון האורגנואידים המוזרקים לכיוון האלקטרודות כך שגליה רדיאלית אפיקלית באזורים דמויי חדרים הפונים לחלק החיצוני של האורגנואיד תהיה ממוקדת.
  10. חבר את הכבלים לתא האלקטרופורציה כאשר הצד המוזרק של האורגנואיד פונה לקוטב החיובי (אנודה; איור 2D).
  11. לחץ על לחצן הדופק של מכשיר האלקטרופורטור כדי לבצע אלקטרופורטציה עם חמישה פולסים של 38 וולט למשך 50 אלפיות השנייה כל אחד במרווחים של שנייה אחת.
    הערה: הגדרות האלקטרופורציה עשויות להיות תלויות באלקטרופורטור הזמין וייתכן שיהיה צורך למטב אותן.
  12. חזור על שלבי ההזרקה והאלקטרופורציה עד לעיבוד המספר הרצוי של אורגנואידים.
  13. אסוף את האורגנואידים המחושלים בתווך ב- RT עד שכל הדגימות עבור אותו מצב יעובדו. ודא שהם לא נמצאים מחוץ לחממה במשך יותר מ -30 דקות בסך הכל.
  14. לאחר מכן, להחזיר את hCOs מחושמלים למדיום התרבית המתאים ולתרבת אותם מבלי לרעוד במשך 24 השעות הראשונות.
    הערה: לאחר 2-3 ימים, אות ה-GFP אמור להיראות ב-hCOs מחושמלים תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי (איור 2H). יש לבחור את נקודת הזמן של הניתוח לאחר אלקטרופורציה בהתאם לשאלה הביולוגית שיש לענות עליה. לאחר 3-7 ימים, תאים חיוביים ל-GFP ממוקמים על פני VZ, SVZ ו-CP15,60.

8. קיבוע והקפאה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים מחושמלים

  1. תקן אורגנואידים מחושמלים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 30 דקות ב-RT בצינור תגובה של 2 מ"ל.
    אזהרה: PFA רעיל ומסרטן. בצע את כל השלבים הקשורים ל- PFA מתחת למכסה אדים. מומלץ מאוד להשתמש בכפפות ניטריל ובמשקפי מגן.
  2. יש לשטוף פעם אחת ב-PBS למשך 5 דקות ולאחסן ב-30% סוכרוז סטרילי מסונן ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד שהרקמה רוויה לחלוטין בסוכרוז.
  3. הטמע אורגנואידים קבועים בתווך הטבעה עבור דגימת רקמה קפואה בתוספת 15% סוכרוז ב- PBS בגושים על קרח יבש.
  4. הכינו מקטעים של 20-30 מיקרומטר בהקפאה ואספו את הרקמה על שקופיות דבק26,64.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול ברגע שהאורגנואידים הקבועים נמצאים בסוכרוז (יציב ב-4°C למשך מספר חודשים) או מוטמע בתווך הטבעה (בלוקים קפואים ניתן לאחסן בשקיות אטומות לאוויר ב-20°C למשך מספר חודשים עד שנים).

9. ניתוח אימונוהיסטוכימי של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים מחושמלים

  1. לניתוח אימונוהיסטוכימי26,64, בצע אחזור אנטיגן במאגר ציטראט (10 mM נתרן ציטראט, 0.05% פוליסורבט 20 ב- dH2O, pH 6.0) למשך שעה אחת ב- 70 ° C באמבט מים.
  2. שטפו פעם אחת ב-PBS במשך 5 דקות, ואז ייבשו שקופיות קצרות והקיפו את המקטעים בעט שעווה.
  3. יש להרוות באמצעות גליצין 0.1 M ב-PBS (pH 7.4) למשך 30 דקות ב-RT ולאחר מכן לשטוף אותו פעמיים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד.
  4. כסו את המקטעים בחיץ חוסם (10% נסיוב סוסים, 0.1% אוקטוקסינול 9 ב-PBS) ודגרו במשך 30 דקות ב-RT.
  5. הכינו את הנוגדנים הראשוניים בחיץ חוסם ודגרו על מקטעים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. למחרת, שטפו שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת, דגרו עם נוגדנים משניים ו-DAPI בחיץ חוסם למשך שעה אחת ב-RT, ושטפו שוב שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת.
  7. הרכיבו את השקופיות במדיום ההרכבה וצלמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3).
    הערה: מומלץ לכלול נוגדן נגד הפלואורופור המשמש בתמהיל ההזרקה כדי לזהות תאים ממוקדים מכיוון שהאות המקורי מרווה, לעתים קרובות לאחר הקיבוע. נוגדנים וצבעים המשמשים לצביעת אימונופלואורסצנטיות, כפי שהם מיוצגים באיור 3, מפורטים בטבלה 1.

10. אימות נוקאאוט בתיווך CRISPR/Cas9 ברמת החלבון

  1. כדי לאמת את הנוקאאוט ברמת החלבון, בצעו אימונוהיסטוכימיה עבור חלבון המטרה על האורגנואידים המחושלים (איור 3I).
  2. דמיינו גם את בקרתg LACZ וגם את האורגנואידים הממוקדים באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה של עוצמת הפלואורסצנטיות (איור 3I, J). עשו זאת באופן ספציפי לאזור כדי להשוות את ההשפעה על סוגי התאים השונים של הניאו-קורטקס המתפתח. ספירת תאים ב- ImageJ/Fiji (מונה תאי תוסף) או על ידי פילוח באמצעות תוסף StarDist 65.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אבלציה גנטית בתיווך CRISPR/Cas9 דורשת תכנון של gRNAs. באופן כללי, מיקוד אחד האקסונים הראשונים של גן מעניין עם זוג gRNA במרווחים של 7-11 bp זה מזה (הימנעות מכפולות של 3 bp) עובד היטב (איור 1A). כבדיקה ראשונה, ניתן לחקור את יעילות זיהוי התבניות על ידי gRNA במבחנה באמצעות תב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אורגנואידים מוחיים וקליפת המוח האנושיים הפכו למודלים מרכזיים לחקר התפתחות הניאוקורטקס האנושי 7,16,17. עבור מודלים של הפרעות אנושיות, קווי hiPSC איזוגניים ואורגנואידים הפכו לתקן הזהב68. עם זאת, מכיוון שיצירת קוו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה למתקנים של שותפי CRTD ו- Dresden Concept על התמיכה יוצאת הדופן שניתנה, במיוחד ק. נוימן וצוותה במתקן להנדסת תאי גזע, ה. הרטמן וצוותה במתקן מיקרוסקופיית אור, א. גומפף וצוותה במתקן ציטומטריית זרימה והרטמוט וולף מסדנת MPI-CBG לבניית תאי אלקטרופורציה. אנו מודים ליהושע שמידט על המשוב על כתב היד. MA מודה במימון מהמרכז לטיפולים רגנרטיביים TU דרזדן, DFG (אמי נת'ר, AL 2231/1-1), וקרן שראם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL PP Centrifuge Tubes, conicalCorning430791
4D-Nucleofector Core UnitLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capCorningFalcon 352235
6-well plate, nunclon treatedThermo Fisher140675For hiPSC culture
6-well plate, ultra low attachmentCorning3471For organoid culture
A83-01STEMCELL Technologies72022Forebrain medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Air compressorAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Secondary antibody, RRID: AB_2340375; dilution 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Secondary antibody, RRID: AB_162543; dilution 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolIntegrated DNA technologiesCustom design (order as 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA technologies10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Integrated DNA technologies1081060100 µg, from Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)Gibco15290018Forebrain medium 2, 3, and 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anti-GFP primary antibody (chicken, polyclonal)Abcamab13970RRID: AB_300798; dilution 1:2000
Anti-PCGF4 primary antibody (mouse, monoclonal)Millipore05-637 RRID: AB_309865; dilution 1:300
ApoTome fluorescent microscopeZeiss
Ascorbic AcidSigma Aldrich1043003Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-supplement (+ vitamin A)Gibco17504044Forebrain medium 3, 4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Banana to Micrograbber Cable KitHarvard Apparatus BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR machine)Analytik Jena846-2-070-723
Capillaries, borosilicate glass with filament, OD 1.2 mm; ID 0.69 mm; 10 cm lengthScience ProductsBF120-69-10Need to be pulled to specific thickness
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Forebrain medium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenase Type IVGibco17104019
CRTDi004-AStem Cell Engineering Facility at CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-ASingle-cell adapted hiPSC line from healthy donor
DAPIRoche102362760011 mg/mL stock, use 1:1000 diluted for IF
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73884Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Forebrain medium 1, 2, and 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Forceps, straigth, 11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemHarvard Apparatus BTX45-2052
EthanolSigma Aldrich32205-1L-M
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Fetal Bovine Serum (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97For pulling of microcapillaries
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware version 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; underlined nucleotides = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Forebrain medium 1, 2, 3, and 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1this paper5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponds to the KO images in Figure 3I+J)
gPCGF4 KO2this paper5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponds to the KO images in Figure 3I+J)
HEPESmade in house1 M stock
Horse Serum, heat-inactivatedGibco26050088
Human GDNF Recombinant ProteinThermo Fisher450-10Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Human/Mouse/Rat BDNF Recombinant ProteinThermo Fisher450-02Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Hydrochloric acid (HCl)Sigma Aldrich258148To make TrisHCl
ImmEdge (wax) PenVector LaboraoriesH-4000
Insulin solution humanSigma Aldrich I9278Forebrain medium 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Knockout Serum ReplacementGibco 10828-010Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Laser Scanning Confocal 980 MicroscopeZeiss
Low Melting Point Agarose, ultra pureThermo Fisher16520100for embedding of hCOs during vibratome sectioning
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-freeCorning354230For organoid culture
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-freeCorning354277For hiPSC culture
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
Microinjector PicoPump + Foot SwitchWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader Pipette Tips 0.5 to 20 µLEppendorf5242956003For loading of glass capillaries
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Stem cell medium
N-2 supplementGibco17502048Forebrain medium 2, and 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Neubauer counting chamberBrand718605
Neurobasal mediumGibco21103049Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Non-Essential Amino AcidsGibco 11140050Forebrain medium 1, 2, 3, and 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Nuclease-Free Duplex BufferIntegrated DNA technologies1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583Embedding medium for frozen tissue specimen
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldehydeFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way Embedding Mold TruncatedT12Polysciences Inc.18986-1For embedding of hCOs for vibratome and cryo-sectioning
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco15140122Forebrain medium 1, 2, 3, and 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 and for stem cell medium after nucleofection
Petri Dish 60 mm x 15 mm, No Vent, SterileCorningBP50-02
Petri Dish Platinum Electrode Chamber, 5 mm gapHarvard Apparatus BTX45-0504
Phosphate buffered saline (PBS)made in house
Proteinase KSigma AldrichP2308From Titrachium album; 10 mg/mL stock
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
RHO/ROCK pathway inhibitor (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Forebrain medium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Sodium Citrate DihydrateSigma AldrichW302600-1KG-K
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma AldrichL3771
Sucrose Sigma AldrichS7903
SuperFrost Plus adhesion slidesFisher Scientific10149870
SZX10 with a KL 300 LEDOlympusSZX10Or alternative stereoscope
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284a.k.a. Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503To make TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Dissociation enzmye to make single-cell suspensions
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polysorbate 20
Tyrode's saltSigma AldrichT2145-10x1l
Vibrating Microtome (vibratome)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 µL Universal Fit Filter TipsCorningTF-1005-WB-R-S
β-MercaptoethanolGibco 21985-023Forebrain medium 1, 3, and 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15

References

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved