עבודה זו נתמכה על ידי קרן הזיכרון Uehara של יפן (כדי ES) וכן קרן וייטהול, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ ואת פרס שטיין אופנהיימר הקרן (עד BSK).

ניסיונית נהלים הליך הניסוי מורכב משני חלקים מרכזיים המתוארים בצורה צעד חכם למטה. חלק 1: הכנת לתרבויות ASTROCYTE בהיפוקמפוס בקצרה, מעורבים ההיפוקמפוס astrocyte-נוירון תרבויות הוכנו באמצעות פרוטוקול מבוסס היטב 1,2,3. אנו אופטימיזציה הליך להניב האסטרוציטים תרבותי בריא. כל הנהלים המפורטים להלן אמור להתבצע בסביבה סטרילית כמו מכסה המנוע זרימה למינרית. הכנת coverslips <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22 מ&quot;מ coverslips (VWR, 48380-068) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Poly-D-ליזין (PDL, סיגמה P0899), aliquots (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laminin aliquots (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל): להוסיף 49 מ&quot;ל של מים סטריליים עד 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון laminin (Sigma L2020), לעשות aliquots 1.2 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים PDL במים סטריליים (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי coverslips, לשטוף עם מים סטריליים במקום ב PDL (20 מ&quot;ל עבור 100 coverslips). השאירו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PDL עם מים סטריליים (3 שוטף נרחב). לאחר מכן לייבש את coverslips ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני ציפוי האסטרוציטים, coverslips המקום היחיד בבאר סטרילי בצלחת 6-באר (Multiwell Flat-Bottom צלחות עם מכסים, סטרילי מ BD Bioscience). שימי 400 μl של laminin על coverslip כל דגירה לילה, בחממה, כדי למנוע אידוי. </li></ol> בתור Dissection התקשורת: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל מלח מאוזן ארל של פתרון (EBSS) (1X), נוזל (Invitrogen, 14155-063) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל HEPES פתרון (Sigma, H0887) </li></ul> בהיפוקמפוס התקשורת: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 412.5 מ&quot;ל בינוני Essential Minimum (מ) (1X), הנוזל מכיל מלחים של ארל, אך לא אדום L-גלוטמין או פנול (Invitrogen, 51200-038) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל גלוקוז (Sigma, D-(+), גלוקוז anhydrous SIGMA ULTRA G7528) 1 M ב ממ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pyruvate 5 מ&quot;ל נתרן פתרון (Sigma, S8636) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12.5 מ&quot;ל HEPES פתרון 1 M (Sigma, H0887) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל N-2 מוסף (100x), נוזל (Invitrogen, 17502-048) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל סרום סוס, חום מומת (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Papain פתרון: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של התקשורת לנתיחה לתוך בקבוקון PAPAIN-022 וורטינגטון (LK003178; הריכוז הסופי, 20 U / ml) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף גורים בני חולדה P1 (בדרך כלל 2 גורים) בעקבות הנחיות בדקה ואושרה על ידי תקנות לאומיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של עור הגולגולת והמוח מקום בצלחת פטרי מלאות התקשורת לנתיחה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסר קרומי המוח, לנתח את שתי ההמיספרות ו לנתח hippocampi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים את hippocampi אל ~ חתיכות 1x1 מ&quot;מ לעכל בפתרון papain על 37 מעלות צלזיוס במשך 11-13 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פיסות הרקמה התיישבו, להסיר בזהירות papain להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום בהיפוקמפוס כדי להסיר כל עקבות של האנזים. חזור על שלב זה resuspend במדיום בהיפוקמפוס (2 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate התאים ~ 5 פעמים עד שאין גושים שמאל, עם שלושה להבה מלוטש pipettes של טרחנים קטנים יותר ויותר (1000 מיקרומטר, 500 מיקרומטר ו ~ ~ 300 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturated פעם אחת, להעביר את התאים דרך מסננת תא (גודל הנקבוביות, 70 מיקרומטר, BD Bioscience). ספירת התאים μl 10 ההשעיה. כוון את עוצמת הקול של המדיום בהיפוקמפוס כדי שיהיה 400,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את laminin coverslips, ולפני מכסה את יכולה יבש, 200 צלחת μl של ההשעיה תא לכל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עזוב אותם לצרף דקות 60 בחממה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ&quot;ל של מדיום בהיפוקמפוס בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב בינוני בהיפוקמפוס הישן כדי להסיר תאים מתים ופסולת ומוסיפים 2 מ&quot;ל של מדיום מראש חימם בהיפוקמפוס טריים. </li></ol> תחזוקה Neurobasal התקשורת: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל B27 בסרום תוספת חינם (Invitrogen, 17504-044) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.25 מ&quot;ל L-גלוטמין (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> הזנת ה-astrocyte נוירון תרבויות פעמיים בשבוע עם המדיום neurobasal, החל ארבעה ימים לאחר ציפוי. Preincubate התקשורת על 30 דקות בחממה בבקבוק מאוורר לאזן את הטמפרטורה ו-CO 2. חלק 2: הדמיה סידן הקלטה חיץ בהיפוקמפוס: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl 2, 0.8 mM MgCl 2, 10 mM D-גלוקוז, HEPES 10 מ&quot;מ (כל כימיקלים Sigma) 7.4 pH (מנוכה עם NaOH). טוען אינדיקטור צבע סידן לתוך האסטרוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התרבות בבאר בצלחת 6-טוב מלא 2 חיץ מ&quot;ל בהיפוקמפוס הקלטה המכיל 2.5 מיקרומטר Fluo-4, בבוקר (Invitrogen, F-14217) ו Pluronic 0.05% ® פתרון ה-F-127 20% DMSO (Invitrogen, P-3000MP) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Fluo-4 פתרון ולשטוף coverslips 3 פעמים עם חיץ הקלטה דגירה בהיפוקמפוס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslip על החדר, לנקות את הצד השני של coverslip עם נוזל לניקוי עדשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים טיפה אחת קטנה של שמן טבילה (שמן טבילה TYPE DF מ Cargille) על המטרה ולשים תא (תא פתוח coverslip 25 מ&quot;מ עגול מבית וורנר מכשירים) על הבמה של המיקרוסקופ (אולימפוס IX71). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראו את התאים באמצעות שידור אור כדי לראות כיצד התאים נראים, ולקבל אותם אל המוקד. ואז להאיר את התאים עם 488 ננומטר מתוך monochromator (צבעוני V מ עד Vision) ולקבוע אם האות פלואורסצנציה של Fluo-4 הוא אחיד לזיהוי האסטרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש EPI ו TIRF תאורה למדוד סידן האסטרוציטים. </li></ol> TIRF מיקרוסקופיה בקצרה, אנו משתמשים במיקרוסקופ IX71 אולימפוס מצויד במצלמה iXon אנדור EMCCD DV887DCS. השליטה של ​​עירור ורכישת התמונה מושגת באמצעות תוכנת TILLVision. הקורות של 454/488/515 ננומטר ארגון (100 mW) ו - 442 ננומטר של מצב מוצק (45 mW) לייזרים משולבים ומבוקר עם עד Polyline לייזר combiner, מעבה TIRF נמל כפול ולסנן tuneable acoustoptical הבקר (AOTF; כל מ עד Photonics) ו fed לתוך סיב הלהקה Kineflex רחבה לכניסה הקבל TIRF. אנו משתמשים 60x עדשת אולימפוס 1.45 NA להשיג TIRF. לזכות המצלמה מותאמת עבור כל astrocyte לספק את האות הטוב ביותר לתמונות רעש. הרקע והעקרונות של מיקרוסקופיה TIRF נבדקו לאחרונה 4, 5. מרבית הרכיבים האופטיים אנו משתמשים נרכשו מ עד Photonics, המהווה כיום חלק Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). עומק החדירה TIR ניתן לחשב משוואות להלן. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="משוואה" /> d = חדירה לעומק n1 = מקדם השבירה של זכוכית = n2 מקדם השבירה של התא זווית = של שכיחות נאי = הצמצם המספרי של שכיחות על מנת להבטיח את הלייזר מיושר בצורה אופטימלית עבור TIRF אנו מוצאים את זה שימושי כדי לצפות 100 ננומטר פלורסנט חרוז (Invitrogen, F8803). אנו מציגים עדיין מסגרות וקטעי וידאו של חרוזים עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. כאשר ב TIRF, אחד מציין עלייה דרמטית האות לרעש-to-וחרוזים התצוגה דיפוזיה בראונית. אנחנו מוצאים את זה שימושי כדי לבחון את התנהגותם של 100 ננומטר חרוזים עם מיקרוסקופיה TIRF על בסיס קבוע (~ פעם בשבוע) כדי להיות בטוח כי TIRF אופטימלי מתרחש, ולא בתאורה אלכסונית נפגעת כי היה להתרחש אם זווית ביקורתית לא היו שווים α (ראה איור 1). יישום ה-G-חלבון אגוניסטים לקולטן מצמידים האסטרוציטים להביע מגוון של GQ מצמידים קולטנים 6, 7 כולל קולטני גלוטמט metabotropic ואת הקולטנים P2Y (אגוניסט, ATP, ADP). ההפעלה של רצפטורים אלו מוביל עליות משמעותיות רמות הסידן בתוך האסטרוציטים תאיים. למשל, אפשר בקלות להבחין הגבהים סידן תאיים במהלך היישום של ה-ATP (30 מיקרומטר) ל 8-10 האסטרוציטים. אנו משתמשים פתרון מהיר switcher מ וורנר מכשירים שנקרא VC-77SP Fast-Step System זלוף (http://www.warneronline.com/index.cfm). עם פתרונות בשיטה זו ניתן ליישם בתוך פחות מ ~ 10 מילישניות. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="איור 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> באיור 1. קריקטורה ותצלומים של הדמיה להגדיר. א מציג תצלום של המיקרוסקופ רכוב על airtable, ואילו (ב) מראה תמונה של האסיפה לייזר, בקרי ותיבות הקורה. ג מציג תמונה של הבמה מיקרוסקופ עם תא רכוב הדמיה. משמאל המכשיר זלוף מהיר ניתן לראות (יחד עם מנוע צעד צינורות תטא). מימין headstage של מגבר Axopatch 200A נתפסת. הקריקטורה schematizes נתיב האור להגדיר את מעלה כמה TIRF מושגת. הלייזר מתמקדת במישור המוקד האחורי של העדשה 60x NA 1.45 אובייקטיבי מעמדה מותאם מחוץ למרכז כך עולה לתוך השמן טבילה ב α זווית ביקורתית. בשלב זה קרן סובל השתקפות פנימית מוחלטת דועך עם λ מרחק (ראו משוואה בטקסט הראשי) לתוך המדיום של מקדם השבירה נמוך. במקרה זה מדובר החיץ שמסביב הקלטה האסטרוציטים ואת האסטרוציטים עצמם. התוצאה היא עירור אופטי (ובכך הדמיה) של מולקולות בתוך ~ 100 ננומטר של הממברנה הפלסמטית. בקריקטורה של התא הזה מוצג ירוק קולטנים &quot;נרגש&quot; קרום, ואילו אלה בתוך התא או על המשטח העליון של התא הם לא מתרגשים. החשבון המלא של מיקרוסקופיה TIRF סופק על ידי Steyer ו Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="איור 2" /> איור 2. תמונות של 100 ננומטר חרוזי ניאון רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א מציג תמונות EPI של שדה הראייה עם כמה עשרות חרוזי 100 ננומטר ניאון. נקודת החצים האדומים כדי חרוזים כי יש התיישבו על coverslip הזכוכית, בעוד ראשי חץ כחול הצבע חרוזים כי הם לשדר במים. ב &#39;מציג תמונה TIRF של אותו שדה הראייה כפי שמוצג א בתצוגה זו רק את החרוזים חסיד שמוצג על ידי החיצים האדומים הם גלויים. הסיבה לכך היא כי אלה התיישבו על coverlsip הזכוכית היו אפוא בתחום 100 ננומטר ~ חלוף. חרוזים שמוצג על ידי החצים הכחולים אינם בתוך האזור הזה הם בלתי נראים אפוא את התמונות TIRF. מגרשים התחתון להראות טיוח 3D של התמונות. ברור כי עלייה גדולה האות לרעש-to-מתרחש עבור חרוזים בתחום חלוף כאשר נצפתה על ידי מיקרוסקופ TIRF. למעשה, עבור תמונות אלו את האות לרעש עבור EPI היה 7.1 ± 0.6, ואילו TIRF זה היה 20 ± 0.7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="איור 3" /> איור 3. תמונות של האסטרוציטים עמוסה Fluo-4 צבע סידן אינדיקטור רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א EPI תמונות של שדה הראייה עם חמישה האסטרוציטים. ב התמונה TIRF של אותו שדה הראייה שמוצג ב הערה כי תמונות A ו-B הם שונים באופן משמעותי. הסיבה לכך היא כי עם TIRF תאורה רק הממברנה הפלסמטית האזורים הפרד קרוב coverslip הזכוכית הם צילמו. לוחות נמוך להראות ATP-עורר הארעיים סידן תוך תאי צילמו עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF.

<ol>
	<li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats.">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li><li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane.">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes.">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li><li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons.">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li><li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIA:+listening+and+talking+to+the+synapse.">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li><li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks.">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li><li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li><li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes.">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li><li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li><li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors.">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li><li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons.">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li><li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li></ol>

היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים להציג הגבהים סידן תוך תאי. אלה מתרחשות באופן ספונטני, יכול להיות מופעלות על ידי הפעילות העצבית או על ידי יישום של אגוניסטים כדי להפעיל את הקולטנים על פני השטח astrocyte 11. נושא אחד חשוב במחלוקת היא האם astrocyte הגבהים סידן תוך תאי יכול לעורר את שחרורו...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>VWR&#174; Micro Cover Slips, Round, No. 1</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48380-068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P0899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Earle&#x2019;s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14155-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle's salts, but no L-glutamine or phenol red</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>51200-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES solution 1 M</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H0887</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-2 Supplement (100X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502-048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse Serum, Heat-Inactivated</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26050-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAPAIN-022</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LK003178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal&#x2122; Medium (1X) Liquid without Phenol Red</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12348-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Strainers</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3911</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2 hexahydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>21108</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2 hexahydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES free acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-14217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic&#174; F-127 20% solution in DMSO</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immersion Oil TYPE DF</td>
<td>Microscope</td>
<td>Cargille</td>
<td>16242</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 &mu;l volume</td>
<td>Tool</td>
<td>WARNER Instruments</td>
<td>64-0362 (RC-21BDW)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater</td>
<td>Tool</td>
<td>WARNER Instruments</td>
<td>64-0278 (P-2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &mu;m, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F8803</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes

המוח מכיל ותאי גלייה. האסטרוציטים, סוג של תא גליה, כבר מזמן ידוע לספק תפקיד תומכת פסיבית נוירונים. עם זאת, הראיות עולה כי הגדלת האסטרוציטים יכולים גם להשתתף באופן פעיל תפקוד המוח דרך אינטראקציות פונקציונלי עם הנוירונים. עם זאת, היבטים בסיסיים רבים של הביולוגיה astrocyte נותרו שנויים במחלוקת, לא ברור ו / או נחקרו בניסוי. נושא אחד חשוב בדינמיקה של הארעיים סידן תאיים ב האסטרוציטים. זה רלוונטי כי סידן הוא הקים גם שליח שנייה חשוב כי זה הוצע כי הגבהים סידן astrocyte יכול לעורר את שחרורו של משדרי של האסטרוציטים. עם זאת, לא היתה כל תיאור מפורט או מספקת של סידן קרום ליד הפלזמה איתות האסטרוציטים. סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח אירועים איתות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתוך כ 100 ננומטר של קרום הפלזמה של תאים חיים. כאן, אנו משתמשים במיקרוסקופ TIRF ולתאר כיצד לפקח ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי כמעט בו זמנית. חידוד נוסף יישום שיטתי של גישה זו יש פוטנציאל להודיע ​​על פרטים מדויקים של איתות סידן astrocyte. הבנה מפורטת של הדינמיקה סידן astrocyte עלול לספק בסיס להבנה אם, איך, מתי ולמה האסטרוציטים ונוירונים לעבור סידן תלויי אינטראקציות תפקודית.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes at JoVE.com

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K Views.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

Video: Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...