בהדגמת ההליך יהיו הסטודנט ז'ה זאנג, מומחה המחקר ננאן ז'אנג, הפרופסורים אילקר אוזדן ושיינגחואה דינג. המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח אסטרוציטים ספציפיים לסוג התא ואת הנוירונים ואת שיטת פילוח מיטוכונדריאלי עבור במבחנה ו in vivo ספירות מיטוכונדריאליות של הדמיה באמצעות אינדיקטור סידן מקודד גנטית, GCaMP5G ו 6s. עבור הגיהנום או הדמיית ויוו, נבנה פלסמידים DNA המכיל אסטרוציטים או נוירונים מקדמים ספציפיים gfaABC1D או CaMKII ומחווני סידן מקודדים גנטית, GCaMP5G/6s עם רצפי פילוח מיטוכונדריאליים.
עבור הדמיית סידן מיטוכונדריאלית במבחנה אנו transfected נוירונים אסטרוציטים בתרבית על פתקי כיסוי זכוכית עם פלסמידים DNA הנ"ל באמצעות שיטת Lipofectamine. הדמיה יכולה להתחיל יום עד יומיים לאחר transfection על ידי העברת כיסוי הזכוכית מחליק לתא שפע תחת אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ שני פוטון. הנה דוגמאות של אותות פלואורסצנטיים מהמיטוכונדריה ואסטרוציטים המבטאים GCaMP6s משמאל, ומיטוכונדריה בנוירון, המבטאים GCaMP5G מימין.
להדמיית in vivo, הכנו את הסרוטיפ 5 הקשור אדנווירוס לביטוי של מיטו-GCaMP5G באסטרוציטים וסרוטיפ 9 הקשורים אדנווירוס לביטוי של mito-GCaMP6s בנוירונים. לניתוחי הזרקת וירוס סטריאוטקסי, אנחנו תחילה מרדים את העכבר עם 3% איזופלוראן. מאוחר יותר במהלך הניתוח, רמות האיזופלוריין מצטמצמות ל -2%לאחר שרמת ההרדמה הנכונה מגיעה, השיער מעל הקרקפת מגולח והעכבר ממוקם על מכשיר כירורגי סטריאוטקס.
משחה עיניים מוחל על העיניים כדי להגן עליהם במהלך הניתוח. ניתוחי ההזרקה מבוצעים באמצעות הליכים אספטיים, כולל מכשירים סטריליים וטכניקות אספטיות. המכשירים הכירורגיים מעוקרים על ידי autoclaving או על ידי מעקר חרוז חם.
לאחר העכבר מותקן על סטריאוטקס, הקרקפת מנוקה עם betadine ו 70%אתנול שלוש פעמים. לאחר מכן העור נחתך פתוח לאורך ציר ברגמה למדה והאנכי נעשה על ידי מקדחה במהירות גבוהה מעל מיקום היעד. בעבודה זו, התמקדנו בקליפת המוח המוטורית או בפרקורטקס.
מזרק המילטון 33 מד נושא וקטור אדנווירוס הקשור מוכנס דרך החור לתוך המוח וקטורים מוזרקים באזור היעד. עבור משלוח קליפת המוח, אנו מזריקים את פתרון הווירוס בשני עומקים במספר שלבים. ראשית, אנו מכניסים את המחט מילימטר אחד עמוק לתוך קליפת המוח.
לאחר מתן חמש דקות למוח להתאושש, אנו מזיזים את המחט עד 700 מיקרומטר עמוק, להזריק 500 ננו ליטרים של פתרון וירוס. לאחר השלמת ההזרקה, אנו מחכים חמש דקות כדי לאפשר לנגיף לפזר במוח. ואז אנחנו מעבירים את המחט למיקום ההזרקה השני בעומק של 300 מיקרומטר.
כאן, אנו מזריקים עוד 500 ננו ליטר של פתרון וירוס. לאחר השלמת ההזרקה, אנו מחכים 10 דקות כדי לאפשר לווירוס לפזר ולאחר מכן אנו מסירים את המחט מהמוח וסוגרים את חור הבר עם שעוות עצם או Kwik-Sil. לבסוף, העור תופר עם Vetbond והעכבר הוא התאושש על כרית חימום לפני שנשלח בחזרה למתקן בעלי החיים.
העכבר יהיה מוכן לשימוש להדמיית in vivo תוך שלושה שבועות לפחות, שהיא מסגרת הזמן שבה ביטוי GCaMP מתבגר. ניתוחי השתלת חלונות גולגולתיים נעשים גם באמצעות תנאים אספטיים כמתואר לניתוחי הזרקה. ההליכים הכירורגיים של חלון הגולגולת זהים להליכים כירורגיים בהזרקה עד לנקודת החשיפה לגולגולת.
ברגע שהגולגולת נחשפת, רבעים של גולגולת בקוטר 2-3 מ"מ מעל האזור המוזרק לווירוס מסומנים בארבעה חורים רדודים שנעשו על ידי מקדחה במהירות גבוהה המחוברת למניפולטור. ואז החלק של הגולגולת, בערוצים של הגולגולת מדוללים על ידי קידוח זהיר ולאט לאט של העצם במעגל, המחבר את ארבעת החורים האלה. ברגע שהגולגולת בגבולות דקה מספיק, אז העצם מורמת עם פינצטה חדה ומוסרת.
ניתן להסיר או לשמור את דורה מאטר חשוף ללא פגע לצורך השתלת חלון הגולגולת. החלון הגולגולתי שלנו מורכב מכיסוי זכוכית בקוטר 3-5 מילימטרים, ויוצר דיסק סיליקון בעובי של כ-300 מיקרון במרכז. הרכבה של חלון הגולגולת מושגת על ידי הצבתו מעל הגולגולת.
חתיכת קיסם המחוברת מניפולטור משמש לדחוף את החלון הגולגולתי בעדינות על פני השטח של המוח. לאחר מכן, קצה החלון הגולגולתי אטום עם כמות קטנה של דבק סיליקון Kwik-Sil. לבסוף, חלון הגולגולת קבוע בשולי הגולגולת עם אקריליק דנטלי.
יש לתת טיפול להחלת אקריליק שיניים מעט על קצוות החלון הגולגולתי עבור מליטה חזקה. כפי שקבוצות מחקר רבות אחרות יישמו בעבר, ניתן להשתמש בג'ל אגרוז 1.2% בין הכיסוי למוח כחלופה לדיסק הסיליקון. לאחר שחלון הגולגולת מותקן באופן מאובטח, לוחית מתכת מחוברת לגולגולת.
צלחת ראש זו תשמש לתיקון ראש העכבר על הבמה של מיקרוסקופ שני פוטון במהלך מפגשי הדמיה. ספיגת סידן מיטוכונדריאלית באסטרוציטים יכולה להיות מעוררת על ידי יישום ATD בעוד ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאי עצב יכולה להיות מעוררת על ידי יישום גלוטמט גליצין בנוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי, עם כוח המשיכה באמצעות מערכת זלוף. ספיגת סידן במיטוכונדריה בודדים אסטרוציטים נוירונים אז ניתן לראות.
הסרטים הבאים מראים ספיגת סידן מיטוכונדריאלית באסטרוציטים שהועלו על ידי ATP משמאל ובנוירון שהופק על ידי גלוטמט וגליקין מימין. ההדמיה נעשית על ידי איסוף תמונות דו פוטון של vivo עם שני פוטונים של אותות פלואורסצנטיים מיטוכונדריאליים באסטרוציטים ונוירונים עם מערכת מיקרוסקופיה דו-פוטונית של אולטימה מ-Prairie Technologies, המצוידת במיליון לייזר טי ספיר אולטרה אחד מקוהרנטי. אנו משתמשים אורכי גל עירור של 880 עד 910 ננומטר, אשר אופטימלי עבור הדמיית ויוו עם GCaMP5G ו 6s.
אסטרוציטים וביטוי ספציפי לנוירונים של מיטו-GCaMP5G ו-6s ואושרו מחדש על ידי לוקליזציה משותפת של תיוג ספציפי לאסטרוציטים של SR101 או סמן ספציפי לנוירונים NeuN. ספיגת סידן מיטוכונדריאלית ספונטנית באסטרוציטים ונוירונים ב- vivo ניתן לראות על ידי הדמיה בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה דו פוטונית. תמונות מראות עלייה ספונטנית בסידן במיטוכונדריה בודדת באסטרוציט משמאל ונוירון מימין.
הגישות שלנו שימושיות עבור סוג תאים ספציפי סידן הדמיה במבחנה ו in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לדמיין ספיגת סידן מיטוכונדריאלי באסטרוציטים ובנוירונים.
