פרוטוקול זה משמש כיום במעבדה שלנו שוכללה במרוצת השנים על ידי אנשים רבים, כולל בני הזוג דוד שארפ, Mijung קוון, פטריציה Sommi, Dhanya Cheerambathur. אנו מודים ד&quot;ר ביל סאליבן (UCSC), אשר סיפק לנו עצה מצוינת על מניפולציה ו microinjection מוקדם של עוברים תסיסנית כאשר עבודתנו במערכת זו היה להיות יזם (ref. 13). אנו מודים לכל חברי המעבדה Scholey. העבודה שלנו על מיטוזה ב תסיסנית נתמך על ידי NIH מענק GM55507.

מתכונים: מיץ ענבים צלחות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5g אגר bacto </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14.5 גרם גלוקוז או דקסטרוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.15 גרם סוכרוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 45 מ&quot;ל מיץ ענבים להתרכז (100% מיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 204.5 מ&quot;ל H 2 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 625 μl 10N NaOH </li></ul> מערבבים את כל החומרים, מיקרוגל עד רתיחה. הוסף 2.8 מ&quot;ל חומצה תערובת (תערובת חומצות: חומצה 20.9 מ&quot;ל propionic, 2.1 חומצה זרחתית מ&quot;ל, 27 מ&quot;ל H 2 0) מערבבים ויוצקים על 35 מ&quot;מ צלחות פטרי. בואו לחזק בטמפרטורת החדר למשך יום או יומיים. אם צלחות לא הולכים לשמש בקרוב, חותם עם parafilm ולשמור על 4 ° C (כדי לאפשר לאזן RT לפני השימוש). שמרים להדביק: ממיסים על כפית אחת של שמרים (Sigma YSC2, שמרים מ Saccharomyces cerevisiae סוג II) במים ליצירת עיסה סמיכה. מניחים כמות קטנה של זה על כל צלחת מיץ ענבים רק לפני השימוש. G-PEM חיץ: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 mM Na-צינורות, pH 6.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM EGTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM GTP </li></ul> הזרקת חיץ: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 מ&quot;מ K-Aspartate </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM K-פוספט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ imidazole, pH 7.2 </li></ul> Heptane דבק: לגולל סרט דביק כפול מקום בבקבוק 100 מ&quot;ל, 50 מ&quot;ל להוסיף על heptane, החותם את הבקבוק, סלע במשך כמה ימים. בעת השימוש, להוסיף heptane אם הדבק סמיך מדי. התייבשות קאמרית: קח צלחת פטרי 100 מ&quot;מ, לשים חלק אחד של צלחת 35 מ&quot;מ בתוך לעשות &quot;שולחן&quot; ולהוסיף Drierite (סידן גופרתי anhydrous) סביבו, כך גובה Drierite אינו גבוה יותר מאשר &quot;שולחן&quot; ואת כיסוי. Coverslip עם עוברי יושם על &quot;שולחן&quot; זה התייבשות לפני הזריקה. זה רעיון טוב להשתמש לפחות חלק Drierite המציין ולשנות כשזה השתנה צבע. פרוטוקול: פרוטוקול זה יכול לשמש הזרקת מגיב כמעט כל מסיס לתוך העובר תסיסנית סינסיציאלי: לדוגמה, או חלבון פלואורסצנטי להסתכלות או מעכב חלבון מטרה או שניהם. התחלת הכל מוכן: 1 .- 2 עד 3 ימים לפני הניסוי, לעשות צלחות מיץ ענבים ולהקים להניח בכלוב: קחו בקבוק פלסטיק (6 גר &#39;, תחתית עגולה מ יישומית מדעי תסיסנית), לחתוך שני חורים קטנים (כ 1cm 2) משני צדי המתרס של בקבוק ולמלא עם פיסת צמר גפן (זה יאפשר זרימת אוויר), הקש על זבובים לתוך הבקבוק ומכסים עם צלחת מיץ ענבים. שמור על 25 ° C (או בטמפרטורת החדר), זבובים צריך להניח עוברים כ 10 ימים. 2 .- לפחות יום אחד לפני הניסוי למשוך מחטים להזרקה, אנו משתמשים מחט Kopf / פיפטה מודל חולץ 720 דק סיבי זכוכית חומה (World Precision מכשירים tw100f). עבור זריקה של טובולין ניאון, לשמור מחטים ב 4 ° C כדי למנוע הטמפרטורה הנגרמת פילמור את המחט. טובולין הכנה: הערה: כל לעבוד עם טובולין צריך להיעשות על 4 ° C כדי למנוע פילמור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח טובולין שכותרתו מהמקפיא והניח אותו על קרח למשך 5 עד 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל עם G-PEM חיץ (4 עד 10 לקפל תלוי בעוצמת חובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 13k ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 1-2 μl לתוך מחט. </li></ol> נוגדן או מעכב כימי: הכן מחטים כמו טובולין, באמצעות ריכוז המתאים (זה ייתכן שיהיה צורך לבדוק). הנוגדן יכול להיות חיץ הזרקה, G-PEM חיץ או PBS. אם עוד חיץ נדרשת, המאגר הזה יצטרך להיות מוזרק כביקורת על מנת לוודא חיץ זה לא גורם נזק משלה. הערה: מעכבי טובולין ו ניאון יכול להיות מעורב והזריקו יחד אם ריכוזי מאפשרים זאת. אחרת, להזריק את טובולין פלורסנט לחכות 5 עד 10 דקות לפני הזרקת מעכבי. בעת ביצוע הזרקה כפולה, להתחיל עם עוברי יותר, שכן עוברים פחות יתאושש כרגיל. העובר באוסף: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מיץ ענבים חדש על צלחת הכלוב מונח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת אחרי שעה אחת, זהו האוסף הראשון של היום, ולעתים קרובות הוא לא כל כך טוב. זה יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הצלחת בכל שעה כדי לשמור על עוברי איסוף במשך שעה אחת. </li></ol> Coverslip הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 50 x 22mm coverslip בצד אחד של המיקרוסקופ שקופית. Tape בארבע פינות לשקופית, כך שהוא לא זז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש כותנה היטה המוליך, לשים שכבה אחת של דבק heptane בשורה אחת על coverslip (דבק לא צריך להיות צמיגה ויש יבש כמה שניות, אחרת להוסיף heptane יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חתיכתכפול סרט דביק בשקופית לעבר הצד של coverslip. </li></ol> העובר הכנה: הערה: עוברים צריך להיות צילמו כ 2 שעות לאחר תחילתו של האוסף, כך להתחיל את הצעדים הבאים לאפשר מספיק זמן כדי לסיים אותם בתוך מסגרת זמן זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מכחול לח בזהירות להרים את העוברים מהצלחת מיץ הענבים ומניחים על נייר דבק כפול בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחלק החיצוני של פינצטה, לגלגל את העוברים על הקלטת דביק כפול עד סיסית (הקרום החיצונית) שובר פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את העובר על ידי בעדינות מגלגלים אותו על סיסית כך שהוא נדבק פינצטה ולמקם אותו על הדבק heptane על coverslip עם הצד הארוך מקביל העובר לצד ארוכה של coverslip. הגדרת 10-20 עוברים בשורה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip ולמקם אותו בחדר התייבשות במשך 3 עד 8 דקות (זה תלוי לחות החדר ואת הסכום להיות מוזרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על חדר מתכת עם גריז ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העוברים עם 700 שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת. עוברים כעת מוכן להזרקה. </li></ol> העובר הזרקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את העוברים תחת מטרה 16x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים הלאה, למצוא את המחט מבלי להזיז את מישור המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את המחט ולהעביר אותה מבלי להזיז אותה בכיוון x או y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המחט אינה פתוחה, לשים את הקצה של coverslip בתחום של נוף, אבל לא איפה המחט תהיה, ולהפחית את המחט למישור מוקד זהה. בזהירות רבה להעביר את coverslip עד שהוא מגיע המחט בעדינות שובר אותו פתוח. אם המחט פתוחה, עבור לשלב 5. (מחטים ניתן לפתוח עם חומצה הידרופלואורית לפני מילוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העוברים בתצוגה (אבל לא איפה המחט יהיה), להוריד את המחט לתוך השמן וודא שאתה להשיג טיפות נוזל נחמד המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות אבל בהתמדה להזיז את העובר לתוך המחט ולהזריק ירידה לתוך העובר ולעבור את העובר משם. (או בצע את ההוראות של מכשיר הזרקה שלך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל העוברים היו מזריקים, הם מוכנים לצורך השגחה על מיקרוסקופ confocal. </li></ol> דימות: תמונה העוברים על מיקרוסקופ confocal במטרה 60 או 100x: הערות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווח הזמן על סדרת זמן לשגות צריך להיות שניות ספורות ביותר, מאז מיטוזה בעובר הוא מהיר מאוד, בהתאם לתהליך המדויק כדי להיחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרת 3D או מטוס אחד ניתן לרכוש בהתאם בתהליך של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מהיר משחק מעכבי, העברת מ מיקרוסקופ הזרקה אל מיקרוסקופ הדמיה חייב להיות מהיר. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="דמות 1" /> איור 1: לימוד מיטוזה בעובר תסיסנית סינסיציאלי. גרעינים בעובר מוקדם לעבור חטיבות מהיר ללא cytokinesis, במהלך 10 מחזורים באמצעות טופס 13 גרעינים monolayer על קליפת.. סכמטי של העובר המוקדם עם גרעינים על קליפת המוח. העובר יכול לבטא את ה-GFP ו / או RFP חלבונים שכותרתו וניתן microinjected עם חלבונים שכותרתו אחרים ו / או מעכבי. פקיעה ב זמן הדמיה של העובר מביע GFP-טובולין ו-RFP היסטון. מגרש ג ההפרדה מוט מוט במשך 11 מחזורים , 12 ו -13 בעובר סוג בר. אורך ציר מפגין תקופות של אורך איזומטרי ותקופות של התארכות, אשר עולות בקנה אחד מאוד לשחזור. Dynamics ד microtubules ציר. הזרקה של ריכוז נמוך של טובולין rhodamine מוביל speckles יצרו של טובולין כמה יחידות משנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד הדינמיקה microtubule.

<ol>
	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

פרוטוקול זה היא פשוטה יחסית, עם זאת, כל צעד דורשת תרגול כדי לוודא את העוברים שאינם פגומים. ניסויים בקרה קפדנית תמיד צריך להיעשות כדי להבטיח תוצאות אמינות עוברים שהושגו. דרך טובה להתחיל זאת היא על ידי microinjecting טובולין חיץ או rhodamine לעוברי לשלוט בהבעת GFP-טובולין לוודא כי מיטוזה התמורה בדרך כלל דרך מחזורי כל העובר על פני השטח (מחזורים 10 עד 13). בשנת עוברים בקרת אתה לא צריך לצפות כל חיבורים פיזיים בין spindles אשר לעתים תוצאה של התייבשות יותר מדי, כך נמוך יותר זמן התייבשות. כאשר עוברים פגומים, הנשורת הגרעינית הוא נצפה לעיתים קרובות, centrosomes חינם או ריווח אחיד של גרעיני או spindles המעידים על נזק. מגרשים של המרחק מוט מוט ולייצר מאוד והם אמצעי אמין מאוד של &quot;הצלחה&quot;, בעוברים לשלוט הם צריכים להיראות כמו שמוצג באיור 1. השתמשנו בפרוטוקול זה ללמוד היבטים רבים של הרכבה תחזוקה, ציר ואת התארכות שימוש חד שבטיים, נוגדנים פפטיד או polyclonal העלה נגד החלבון של עניין 1,5,6,7,8,9,10,11,12,13. מעכבי חלבון מסוים או כימיקלים אחרים המשפיעים על חלבון של עניין ניתן גם microinjected והשפעתם נצפו ונמדדו כמותית. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי מסוים, אנו משווים את אורך ציר לאחר עיכוב לזה שנצפה עוברים שליטה. אנחנו יכולים גם להסתכל על הדינמיקה טובולין באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב 14 לאחר microinjection של ריכוז נמוך של טובולין ניאון (איור 1d). בדרך כלל אנחנו אוספים במשך שעה אחת ולתת עוברים בוגרת במשך שעה אחת לפני יותר תצפית, פירוש הדבר כי הם עוברים בין 1 ל 2 שעות הישן, כאשר ציין. אם הזבובים מניחים היטב עוברים רבים נאספים בשעה אחת, אז בפעם אוסף עשוי להתקצר כך עוברים סינכרוני, חלוקת יותר מתקבלים. אם העיתוי של עיכוב הוא קריטי או עניין במחקר, מעכב ניתן להזריק תחת השגחה confocal. זה קשה, אבל זה אפשרי בכל זאת.

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של העובר תסיסנית melanogaster סינסיציאלי ללימוד מיטוזה 1. תסיסנית יש גנטיקה שימושי עם רצף הגנום, וזה יכול להישמר בקלות מניפולציות. מוטנטים mitotic רבים קיימים, וזבובים מהונדס המבטא פונקציונלי fluorescently (GFP למשל) - חלבונים mitotic מתויג כבר והם שנוצר. ביטוי גנים ממוקד אפשרי באמצעות מערכת GAL4/UAS 2. העובר תסיסנית מוקדם מבצעת mitoses מרובים במהירות רבה (משך מחזור התא, ≈ 10 דקות). זה גם מתאים הדמיה מיטוזה, כי במהלך מחזורי 10-13, גרעינים לחלק במהירות סינכרוני בלי להתערב cytokinesis על פני השטח של העובר בשכבה יחידה רק מתחת לקליפת המוח. גרעינים אלה במהירות לחלק מן הסתם להשתמש במכונות mitotic כמו תאים אחרים, אבל הם אופטימיזציה עבור מהירות, המחסום הוא האמין בדרך כלל לא להיות מחמירים, המאפשרים לימוד של חלבונים mitotic שחסרונו יגרום מחזור התא בתאי מעצר עם מחסום חזק . עוברים לבטא חלבונים GFP שכותרתו או microinjected עם חלבונים שכותרתו fluorescently ניתן הדמיה בקלות לעקוב אחר הדינמיקה חיים (איור 1). בנוסף, עוברים ניתן microinjected עם פונקציית חסימת נוגדנים או מעכבי חלבונים ספציפיים כדי לחקור את ההשפעה של אובדן או ההפרעות בתפקוד שלהם 3. ריאגנטים אלה יכולים לפזר לאורך העובר, והגיע spindles רבים לייצר שיפוע של ריכוז מעכב, אשר בתוצאות פונים שיפוע של ליקויים דומים סדרה allelic של מוטציות. באופן אידיאלי, אם חלבון המטרה היא שכותרתו fluorescently, שיפוע של עיכוב ניתן דמיינו ישירות 4. ההנחה היא כי הפנוטיפ החזקים ניתן להשוות פנוטיפ ריק, אם כי קשה רשמית לשלול את האפשרות כי הנוגדנים יש תופעות הדומיננטי במקרים נדירים, בקרות מחמירות כל כך פרשנות זהירה חייב להיות מיושם. הרחק הזריקה, תפקוד החלבון הוא רק איבד חלקית ומאפשר פונקציות אחרות של חלבון המטרה להיות ברור.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; העובר סינסיציאלי ללמוד מיטוזה.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

14.0K Views.  University of California, Davis. פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של תסיסנית melanogaster העובר סינסיציאלי ללמוד מיטוזה.

Video: Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.