המחברים מבקשים להודות אקירה צ&#39;יבה לתמיכה רוחני, תמיכה חומרית, ומניות. הודות לג&#39;וליה Dallman להערות.

1. טוס עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על זבובים על מדיום קמח תירס, אגר ולסה, שמרים סטנדרטיים בטמפרטורת חדר 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלבים, לבודד בתולות בתוך 6 שעות של eclosion. לאחר החצייה לזכרים של הגנוטיפ הרצוי, השינוי טס לבקבוקונים חדשים בכל 3-4 ימים. </li></ol> הערה: בניסויים אלה, קו Gal4 A9 שימש לנהוג ביטוי של transgenes באגף. ניתן להשיג במניות טוסו ממרכז המניה בבלומינגטון. מניות המשמשות בניסויים אלה כוללים A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), Sco / הארגון הנוער הקתולי HsCre (BL # 1092), כטב&quot;מ-ChRFP-אמבטיה (BL # 25773), lollibow 11. 2. בחירה והרכבה של גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלמי במה או על ידי איסוף אותם כprepupae הלבן (WPP) ולשמור אותם ב25 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל המתאים, או על ידי שימוש בקריטריונים מורפולוגיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לצפות חלוקות תא, גולם בחר שלאחרונה עבר eversion הראש.מזה זמן עד ממש לפני eclosion (ב&gt; 96 hr), גלמים נמצאים ללא תנועה המאפשרים תצפית ממושכת זמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלמים מהבקבוקונים ידי הנגיעה הראשונה עם מכחול טבול במים, מחכה לרגע כדי לאפשר למים כדי לשחרר את הדבק ואז בעדינות דוחף אותם על המכחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות גלמים שנבחרו על ידי דרבונם עם מכחול במים כדי להסיר חלקיקי דבק בלוטה ומזון הרוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הגלמים נקיים לצלחת פטרי עם 25 מ&quot;מ תחתון coverslip (מספר 1 ½ coverslips). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברצועות דקות של או פלסטלינה או שעוות שיניים כתמיכה, הר גלמים כך שהרקמות של עניין היא הקרובות ביותר לcoverslip. הערה: במחקרים שתוארו כאן, כנפי גלמים, רגליים, בטן או histoblasts notum הגבי כבר נצפו. בפועל, כל רקמה בתוך 20 מיקרומטר של פני השטח של המקרה גלמי היא הנצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלמי אוריינט בזהירות, כדי שTissuדואר של עניין הוא מקביל אל פני השטח coverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגלמים הם רכובים, להשתמש במכחול להעביר שכבה דקה של thiodiethylene גליקול (TDG) למרווח שבין הגולם וcoverslip. </li></ol> הערה: TDG מפחית פיזור פני השטח, תואם את מקדם השבירה של שמן, ומאפשר לחמצן כדי לחדור את הרקמה 13. שימוש בשמנים אינו מומלץ, כפי שהם נוטים לשלול את הרקמות של חמצן, גורמים להפסקה מהירה של התנהגויות תא. 3. הדמיה הערה: לקבלת הדמיה, מיקרוסקופ confocal עשוי להיות חיוני כמו confocality מסיר את רוב רקע הטשטוש הנגרם על ידי תאורה חזקה של המקרה גלמי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות בconfocal כדי למזער את ההשפעה של תאורה על פיתוח וכדאיות גלמי. לשם כך, איזון בין עוצמת עירור ואת הרגישות של אוסף. תצורה אופיינית לwi הדמיהה SP5 לייקה בשימוש בסורק התהודה (8,000 הרץ), כוח הלייזר מוגדר 2% (העברת 10% מ20% כוח), סט חריר 120 מיקרומטר, וקו מיצוע מוגדר 8. הגדרות ישתנו בהתאם לתנאי ניסוי. </li></ol> הערה: כדי לפתור סולם קנס כולל 40X ו63X עדשות טבילת שמן (מרחק עבודה 0.1 מ&quot;מ) יש גם שימש בהצלחה בשיטה זו, אם כי הם מגבילים את עומק המיקוד. 4. אנליזה כדי לנתח מסגרות, Z-ערימות או סרטים לייבא את קבצי הנתונים לפיג&#39;י, שבה יש כלים יעילים לצפייה, מדידה ושינוי קבצים למצגת 14. לדוגמא זמן כדי להשלים מיטוזה נמדד באמצעות מרווח הדגימה ודפדפן תמונה רב ממדי כדי לעבור מסגרות בעת שצפה מתא prophase לtelophase. ה-X, Y, ו-Z-ממדים ניתן למדוד באמצעות כלי המדידה. להוראות מפורטות על התוכנה והשימוש בהראה: http://fiji.sc/Fiji.

<ol>
	<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332, 354-358 (2011).</li><li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage:+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell.">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li><li>Ninov, N., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila.">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).</li><li>Edgar, B. A., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+cell+cycle+regulators:+a+fly's+perspective.">Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective.</a> Science. 274, 1646-1652 (1996).</li><li>Wirtz, R. A., Semey, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+kitchen:+equipment,+media+preparation,+and+supplies.">The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies.</a> Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).</li><li>Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+multicolor-labeled+cells+in+Drosophila.">Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila.</a> Development. 140, 1605-1613 (2013).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+is+a+broadly+conserved+feature+of+cell+division+in+pseudostratified+epithelia.">Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia.</a> Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).</li><li>Sauer, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כדי להמחיש, למדוד, ולכמת את תכונות של תאים מתחלקים, פיתוח הנדרש של הכנה פשוטה להתבוננות מיטוזה באגף גלמים החי של דרוזופילה באמצעות ניתוח confocal של His2AvGFP לבטא בתאים. שיטה זו שימשה לתיעוד שמחזור התא באגף גלמים מתאפיין בקווי דמיון חזקים לתא מחזורים בepithelia pseudostratified שבמ...

<html> זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל מבוסס היטב ללימוד היבטים רבים של ביולוגיה. יש מחקר דרוזופילה היסטוריה עשירה של ניסויים גנטיים המאפשרת לצורות מתוחכמות של מניפולציה גנטית, כולל ביטוי, מציאה ומוטציה. עם כניסתו של תוויות חלבון פלואורסצנטי, הרפרטואר הזה התרחב והוא כולל מחקרים של תאים וחלבונים חי חיות. עובר הזבוב הוא מערכת מצוינת למחקרים כגון זה הוא קטן וברור אופטי המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עמוקה, in vivo 1-3. שלבים אחרים של התפתחות זבוב הוכיחו להיות פחות צייתן, הדורשים הרדמה 4, לנתיחה ותרבות לטווח קצר 5,6, או יצירה של חלונות בציפורן הדמיה 7,8. מניפולציות אלה בדרך כלל לפגוע בהתפתחות בעלי חיים בטווח הארוך או להשפיע על בעלי החיים בדרכים המגבילות את ההדמיה לתקופות קצרות. אף אוזן גרון &quot;&gt; כדי לחקור מוטציות רומן בגנים שדומים רגולטורים מחזור תא, זה היה חיוני למצוא היערכות מתאימה כדי ללמוד את התזמון ונאמנות של מחזור התא. מאחר שרוב מחזורי תא העובריים מעוגלים (SM או S-G2-M) והמוטציות תחת מחקר לא מראות פגמים עד שלבים מאוחר יותר, זה היה חשוב לקיים את מחזור התא ברקמות שלב גלמים. תאי אפיתל בגולם יש מחזור טיפוסי יותר G1-S-G2-M תא וגלמים של שלב זה הם לא מסוגלים תנועות שרירים 9. נקודת ההתחלה הראשונית למניפולציות כללה כל גלמים שלמים להביע Histone2AV-GFP. למרות האטימות, לכאורה, של המקרה גלמי, הכנה ללא פגע זה הוכיחה את עצמו מצוין לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. טכניקה זו היא פשוטה די בכך שהחוקרים לתואר ראשון באופן שיגרתי להשתמש בו כדי ללמוד היבטים של תא וביולוגיה התפתחותית בדרוזופילה ועדיין הרזולוציה היא בסדר מספיק כדי לאפשר אפליה של תכונות בקנה מידה מיקרומטר. בשיטה זו, תצפיות של אירועים על פני שעות, דקות או שניות הן אפשריות רק על ידי התאמת פרמטרים סדרת הזמן. וידאו באמצעות חלבונים כחולים, ירוקים, צהובים, כתום, אדומים וניאון, או שילוב של אלה, נעשה. חשוב מכך, אם טיפול שננקט כדי למזער את עוצמת הלייזר, יש אפילו הדמיה לטווח ארוך אין כל השפעה על התפתחות או כדאיות של בעלי החיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly stuff fly pad</td>
			<td style="width:71px;">Genesee scientific</td>
			<td style="width:119px;">59-114</td>
			<td style="width:167px;">for fly anesthetization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CO2 gas</td>
			<td style="width:71px;">Airgas south</td>
			<td style="width:119px;">CD50</td>
			<td>For fly anesthetization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas south</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>CO2 regulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly vials</td>
			<td style="width:71px;">Genesee scientific</td>
			<td>32-113RLBF</td>
			<td>Fly culture</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td>
			<td style="width:71px;">Bloomington Stock center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bottom dishes #1 1/2</td>
			<td style="width:71px;">WillCo Wells BV</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thiodiethylene Glycol</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">88559</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Modeling clay</td>
			<td style="width:71px;">art supply store</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Support to position pupae against</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paintbrushes</td>
			<td style="width:71px;">art supply store</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>To manipulate flies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Forceps, Inox #5</td>
			<td style="width:71px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">computer</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>8 Gb RAM for image/movie analysis</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">Fiji software</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;">Free ware http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Any fast scanning confocal should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For imaging tissue, cellular and subcellular features</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil (non fluorescent)</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For fly manipulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging through the pupal case of drosophila melanogaster

השימוש ארוך השנים של דרוזופילה כמודל לתא וביולוגיה התפתחותית הניב מערך של כלים. יחד, בטכניקות אלה אפשרו ניתוח של תא וביולוגיה התפתחותית ממגוון רחב של זוויות מתודולוגי. הדמיה חיה היא שיטה המתעוררות להתבוננות בתהליכי תא דינמיים, כגון חלוקת תא או תנועתיות תא. לאחר שבודד מוטציות בחלבוני מחזור תא המשוערת uncharacterized זה הפך חיוני להתבונן מיטוזה באתרם באמצעות הדמיה לחיות. רוב מחקרי הדמיה לחיות בדרוזופילה התמקדו בשלבים העובריים, כי הם נגישים למניפולציה ותצפית בגלל הגודל הקטן שלהם והבהירות אופטית. עם זאת, בשלבים אלה את מחזור התא הוא יוצא דופן בכך שהוא חסר אחד או שני שלבי הפער. לעומת זאת, יש תאים של אגף גלמים של דרוזופילה מחזור תא טיפוסי ועוברים תקופה של מיטוזה המהירה פורש על 20 שעות של פיתוח גלמים. זה קל ליdentify ולבודד גלמים של השלב המתאים לתפוס מיטוזה באתרם. גלמים ללא פגע הרכבה סיפקו את השילוב הטוב ביותר של עקיבות ועמידות במהלך הדמיה, המאפשרים ניסויים לרוץ במשך כמה שעות עם השפעה מינימאלית על כדאיות תא ושל בעלי חיים. השיטה מאפשרת התבוננות בתכונות קטנה כמו, או קטן יותר, לעוף כרומוזומים. התאמה של הגדרות מיקרוסקופ ואת הפרטים של הרכבה, אפשרה הרחבה של ההכנה כדי להמחיש דינמיקת קרום של תאים סמוכים וחלבונים שכותרתו fluorescently כגון טובולין. שיטה זו עובדת עבור כל חלבוני הניאון נבדקו ויכולה ללכוד תכונות submicron סולם על מגוון רחב של סולמות זמן. אמנם מוגבל ל -20 מיקרומטר החיצוני של הגולם עם מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, גישה זו להתבוננות חלבון ודינמיקה הסלולר ברקמות גלמי in vivo יכולה להיות, בדרך כלל שימושית בחקר התא וביולוגיה התפתחותית ברקמות אלה.

<html> תאים בepithelia pseudostratified, כגון העין פיתוח דרוזופילה, או שכבת חדרית של מערכת העצבים המרכזית של בעלי החוליות בפיתוח, עוברים תנועות גרעיניות, כינה הגירה גרעינית interkinetic, בזמן עם מחזור התא. שכפול הדנ&quot;א מתרחש כאשר גרעינים נמצאים באו סמוך לפני שטח הבסיס ותאים להיכנס מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

imaging-through-the-pupal-case-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

13.3K Views.  University of Miami.  מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר. 

Video: Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

תחזוקה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; אוכלוסיית קייג

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס

מדידה של תוחלת חיים ב

נתיחה והתקנה

תחזוקה של