פרוטוקול זה מאפשר רכישה בו זמנית של עוברים מרובים בתוך מפגש הדמיה אחד. בעוד הכנת מדגם מותאם לרכישה מרובת נקודות באמצעות מנתח תוכן גבוה, דגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה ניתן לדמיין על כל מיקרוסקופ הפוך מסוגל רכישה מרובת נקודות. כדי להתחיל, לארגן שתי שורות של 15 עד 20 עוברים על קטע נקי של צלחת גדולה באמצעות כלי בורר ביצים.
ליישר את העוברים בצד הגחוני שלהם באותו אוריינטציה ביחס לקצוות לפנים ו האחוריים. לדבוק רווח על כיסוי פס 10 microliters של דבק heptane במורד inset זכוכית coverslip חשוף. בזמן שהדבק מתייבש, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך מלבן סביב שתי שורות העוברים.
חותכים מלבן שני ליד הראשון ומסירים את המלבן השני עם צד קצה ישר של מרית נירוסטה. בזהירות להחליק את הקצה הישר של המרית מתחת המלבן הראשון ולהסיר אותו. לאחר מכן, מניחים את החיתוך עם עוברים בצד החיצוני של צלחת 3.5 ס"מ.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, מנמיכים כיסוי מוכן מעל העוברים ולחיצה עדין על שתי שורות העוברים על הדבק. אם לא מבצעים microinjection, למלא את spacer סיליקון באמצע הדרך לפסגה עם אחד לאחד שמן halocarbon 700 לשמן halocarbon 27. מרווים את הקצוות התחתונים של מתאם לוח ארבע שקופיות עם סרט דו-צדדי.
פעולה זו תמנע מהשקופית לנוע במהלך ההדמיה. הקפד לא למקם את הקלטת בנתיב של העדשה האובייקטיבית. תן את המכסה במתאם לוח ארבע השקופיות.
אם microinjecting העוברים, למקם את coverslip עם עוברים מעל שקופית כדי למנוע את החלק התחתון של coverslip מלהיות מלוכלך במהלך ייעוד microinjection. לתעב את העוברים במשך חמש עד 10 דקות, ואז מיד לכסות אותם עם אחד לאחד שמן halocarbon 700 לשמן halocarbon 27, מילוי ספייסר סיליקון באמצע הדרך לפסגה. לטעון שתיים או שלוש מחטי microinjection עם כשני microliters של מזרק באמצעות קצה טעינה מורחבת.
הר מחט על microinjector ולדכא את הבוכנה באמצע הדרך לקצה, להגדיל את לחץ האוויר בתוך נימי הזכוכית. מנמיכים את מחט הזכוכית על מגלשת זכוכית וחותכים את קצה המחט עם סכין גילוח מספר תשע חדש, חותכים בזווית של 45 מעלות כדי לייצר קצה פתוח חד. המזרק צריך לזרום למטה לתחתית הקצה מבלי לזרום מתוך המחט.
בזהירות להוסיף 20 microliters של שמן halocarbon מעל קצה המחט לחתוך אותו מחדש נפתח בזווית של 45 מעלות. ההזרקה צריכה להתחיל לזרום במהירות, אז זכור להתאים את הלחץ על ידי נסיגת הבוכנה. השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את המחט במרכז שדה המבט.
ואז להרים את המחט ולהסיר את מגלשת הזכוכית מתחתיו. מניחים את העוברים על שלב מיקרוסקופ סטריאו, מתחת למחט microinjection ולהתמקד בהם בהגדלה 50 פעמים. מנמיך את המחט עד שהיא מגיעה לאותו מישור מיקוד כמו העוברים.
הזזת השקופית ביד אחת והפעלת המיקרו-מזרק ביד השנייה, מזריקים שורה אחת של עוברים. הרם את המחט וסובב את השקופית 180 מעלות כדי לחשוף את השורה השנייה של העוברים למחט microinjection. מנמיך את המחט ומזריק את שורת העוברים השנייה.
פרוטוקול זה שימש לבחינת תפקידם של microtubules בארגון מחדש של רשתית אנדופלזמית במהלך מיטוזה בעובר Drosophila. ההשפעות של מספר טיפולים תרופתיים microinjected על ארגון מחדש של ER הושוו כמותית. קולצ'יץ'ין, המונע פולימריזציה חדשה של מיקרוטובול, נמצאה כדי להפחית באופן דרסטי את לוקליזציה של ה- ER לעמודי ציר במהלך מיטוזה.
נתוני הדמיית זמן לשגות נרכש עבור 32 עוברים. מדידות ממוצעות ועוצמה מרבית נותחו מ- 12, 800 אזורי עניין באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית. בעת ניסיון פרוטוקול זה בפעם הראשונה, זכור שלא להימשך זמן רב מדי בשלב אחד, אחרת אתה מסתכן בהחמצת השלב ההתפתחותי שברצונך לצלם.
תרגל פרוטוקול זה צעד אחר צעד לפני שתנסה לבצע ניסויים כלשהם. שיטת הכנת הדגימה שלנו מאפשרת רכישה בו זמנית של עוברים מרובים במהלך ניסוי אחד, ובכך מייצרת מספיק שכפולים ניסיוניים לניתוח כמותי. פרוטוקול זה יכול לסייע במעבר עוברי התפתחותי מניסויי הדמיה איכותיים וכמותיים.
היכולת לדמיין עוברים מרובים בתוך מפגש הדמיה אחד מבטלת גם רעש ניסיוני בין שכפולים.
