אנו מכירים מליסה Grunlan לדיונים מועיל על היווצרות SAM. מחקר זה מומן בחלקו על ידי א &#39;רוברט וולטש קרן (A-1585).

הכנה של ריאגנטים הכן צינורות חיץ (80 צינורות מ&quot;מ, 1mm MgCl 2, 1mm EGTA, מותאם pH 6.8 עם KOH). Aliquot וגלוקוז אוקסידאז חנות, Catalase וגלוקוז ב -70 ° C ו טקסול ב -20 מעלות צלזיוס על פי פרוטוקולים קיימים. Aliquot 1,2 ו טובולין חנות ב -70 ° C בהתאם להוראות כלל על ידי הספק. תבנית Au microelectrodes באמצעות ליתוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות סיליקון לתוך 1.5 1 &#39;סמ מצעים ס&quot;מ בעזרת סופר או חותך פרוסות. נקו את מצעים ידי הצבתם בכוס עם אצטון מספיק כדי לכסות אותם sonicate במשך 5 דקות. בלי המאפשר מצעים להתייבש, לשטוף אותם אצטון טרי, ומיד לשטוף בחנקן באמצעות isopropanol ויבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק microelectrodes Au על מצעים נקיים באמצעות תקן, בטון חיובי photolithography או קרן אלקטרונים ליתוגרפיה, בהתאם לגודל של התכונות הרצויות. 3 בעת תכנון הגיאומטריה דפוס, לשמור על תבנית בקוטר של כל אלקטרודה להלן 100 מיקרון, כדי להבטיח כיסוי של PEG SAM (המתואר בסעיף הבא). כלול כריות מגע (~ 300 מ&quot;מ 2) ממוקם 300 מ&quot;מ 500 מהתבנית עם קו 1 מ&quot;מ המחבר את כרית עם האלקטרודה (איור 1). מניחים את תבניות ליתוגרפיות קרוב לאמצע של המצע, כדי לאפשר מרחב סביב התבנית להרכבת הקאמרית הזרימה. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. הגיאומטריה לדוגמה. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התפתחות דפוס בשכבה להתנגד, לגרד קו להתנגד מהפנקס קשר לשפת המצע באמצעות פינצטה (איור 1). לאחר בתצהיר מתכת, שריטה יאפשר מגע חשמלי בין האלקטרודה לבין קצה המצע. תא בתצהיר, רצוי עם שני מקורות, משמש להפקיד את שכבת מתכת. האלקטרודות נוצרות על ידי בתצהיר של 2 ננומטר של Cr (עבור הדבקה) ואחריו 6 ננומטר של Au, בלי לשבור ואקום. Microbalance קריסטל קוורץ מצויד בתוך החדר יכול לשמש כדי למדוד את עובי של סרטים במהלך בתצהיר. </li></ol> הכן את SAM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים בתנור באזור מאוורר היטב על 75 ° C. הכן את הפתרון silanization ידי הוספת 20 מ&quot;ל של טולואן אל מבחנה 250 מ&quot;ל זכוכית. לאחר מכן להוסיף 1 מ&quot;ל PEG-silane (כלומר 5% v / v) ל טולואן בעזרת פיפטה פלסטיק. מערבבים את PEG-silane היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים ואז לערבב עם פיפטה למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות בדוגמת בכוס עם הצד בדוגמת כלפי מעלה, כדי לוודא כי הם שקועים לחלוטין פתרון PEG-silane טולואן מחולקת באופן שווה על פני החלק התחתון של הגביע. מניחים את כוס לתנור ואופים 18-21 שעות 75 ° C. בעוד SAM הוא להרכיב, להכין את counterelectrode (ראה להלן) ולהרכיב כל רכיבים נוספים הנדרשים על יתר השלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18-21 שעות בתנור, טולואן צריך להתאדות עוזב את דגימות בדוגמת משקע ב-PEG silane צמיג. הוסף 20 מ&quot;ל של טולואן על כוס ולספוג את הדגימות עבור 1-2 דקות. הסר את דגימות מן הקנקן ולשטוף עם טולואן, אז isopropanol, ויבש סוף סוף עם חנקן. בשלב זה, הדגימות צריך להיראות נקי שכבת SAM צריך להיות בלתי נראה לעין בלתי מזוינת. סאמס מוכן בדרך זו שמישים למשך יומיים, כאשר הם מאוחסנים בתנאי קריר ויבש (25 ° C, לחות בינונית). לא מוצלחת SAM תוצאות היווצרות ציפוי מעונן או לא אחידה שאריות גוני על פני השטח. </li></ol> לפברק את counterelectrode במהלך ההתקנה קאמרית אותו בתצהיר המשמש בתצהיר microelectrode, לעשות counterelectrode ידי הפקדת 1 ננומטר של Cr, ואחריו 4 ננומטר של Au על 22 x 50 מ&quot;מ מס &#39;1 או מס&#39; 0 coverslip זכוכית. Counterelectrode צריך להיות כמעט שקוף עם גוון אפור או ורוד בהיר. חנות counterelectrode מצופה בצד למעלה בצלחת פטרי כדי לשמור על נקיונו. טובולין לפלמר לתוך MTS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי ללא תווית טובולין ו טובולין rhodamine ומיד לשלב ביחס של 1:02 שכותרתו ללא תווית להשיג MTS בהיר. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. לפלמר טובולין 20-40 דקות באמבט מים חמים על 37 ° C. אורכו של MTS יהיה גדול יותר פעמים פילמור יותר. בעוד טובולין הוא polymerizing, להכין חיץ צינורות, טקסול ידי הוספת טקסול עד 20 מ&quot;מ לתוך צינור המכיל microcentrifuge חיץ צינורות. מערבבים היטב על ידי טקסול pipetting מעלה ומטה מספר פעמים vortexing, ולאחר מכן למקם את הצינור לתוך האמבטיה מחוממת ב 37 ° C. לאחר פילמור, לדלל את MTS על ידי 1 / 100 ב חיץ צינורות, טקסול חם מגןמן האור. MTS מוכן בדרך זו יהיה להאריך לאורך זמן צרור, אשר יכול להיות מופחת על ידי דילול נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת חמצן 10x הדחה (OS) על ידי שילוב של 30 מ&quot;ל קר צינורות חיץ (0-4 מעלות צלזיוס), 5 מ&quot;ל של 50% 2 ​​mercaptoethanol, 5 מ&quot;ל גלוקוז אוקסידאז, 5 מ&quot;ל Catalase, ו 5 מ&quot;ל גלוקוז. 2 גלוקוז יש להוסיף שעברה. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים לאחר הוספת כל רכיב. מניחים את תערובת OS על הקרח, זה יישאר אפקטיבי למשך כ 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי פילמור MT הצליחה MTS וכי הם יציבים תחת כמה דקות של עירור הקרינה על ידי הדמיה MTS מוכן עם תערובת OS 1x. עבור הדמיה MTS מוכן בדרך זו, הקפד להשתמש בשילוב עירור / פליטה פילטר מתאים הקרינה rhodamine. קבע את דילול הטובה ביותר לעבוד חוטים בודדים על ידי הדמיה נוספת דילול MTS על ידי 1 / 10 to 1 / 100 באמצעות צינורות חיץ הדמיה בתערובת OS 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תא תזרים ידי הרבדה גדול (22 x 50 מ&quot;מ) קטן (22 x 22 מ&quot;מ) coverslip זכוכית עם שתי חתיכות של נייר דו צדדית להציב 2-3 מ&quot;מ זה מזה. הקלטת היא לחתוך בקלות על ידי הצבת אותו בשקופית זכוכית חיתוך בסכין גילוח לרצועות. הציגו microliters כמה של MTS לתוך התא זרימה באמצעות micropipette. עבור הדמיה בהגדלה גבוהה, המטרות למרחקים ארוכים עובד עשוי להידרש הדמיה פני השטח העליון של תא את הזרימה. המרחק מפני השטח coverslip / המדגם על פני השטח העליון של החדר תזרים נקבעת על ידי עובי של הקלטת ויש 60-100 מ&quot;מ. </li></ol> תבנית MTS באמצעות אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא אלקטרופורזה על ידי הצבת שתי רצועות דקות של סרט דו צדדית על פני המדגם בדוגמת, SAM מצופה כזה האלקטרודה הוא בין רצועות עם השביל המחבר פועל בניצב הקלטת (איור 2). מניחים את counterelectrode בקלטת דו צדדית עם הצד מתכת נגיעה סרט כזה קצה של הסככות המדגם counterelectrode בכ 3 מ&quot;מ (איור 2). גזור מספר 15 ס&quot;מ באורך של חוטי נחושת מבודדים מגנט רצועה 1 ס&quot;מ של בידוד מעל קצותיו. צרף חוט לאזור Au חשוף של המצע באמצעות טיפה קטנה של צבע כסף בזמן נטילת הטיפול, כדי למנוע יצירת קשר חשמלי עם counterelectrode (זה ניתן לבדוק עם מודד). צרף חוט השני counterelectrode באמצעות צבע כסף. מחוברים חוטים בצבע כסף יכול להיות מאובטח נוספת דגימות עם הקלטת. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="דמות 2" /> 2. תרשים זרימה תא הרכבה עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו MTS בדילול הרצוי באמצעות צינורות חיץ בשילוב עם מערכת ההפעלה בריכוז 1x הסופי. תמונה בהגדלה של 20X ולאתר את התבנית על פרוסות סיליקון סיליקון לפני החלת מתח. לחלופין, החדר הזרימה יכולה להיות חתומה באמצעות לק כדי למנוע זרימת הנוזל והגירה MT במישור של החדר לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח עד V 1 ולבחון ההגירה של MTS. מתח נמוך (עד כ - 0.5 V) עשוי לשמש אם השמנה הפיך של MTS הוא הרצוי, אך זה דורש איטום תא זרימה כדי למנוע סחף לרוחב. לק עובד היטב עבור איטום קצוות פתוחים של החדר לזרום. במתח מעל כ 0.7 V, הידבקות כמה MT ניתן לראות על דפוס, למרות שזה יהיה חלש. במתח מעל כ 0.9 V, ההגירה MT יהיה מהר יותר, הידבקות יהיה חזק יותר. מעל כ 1.2 V את הסבירות עבור אלקטרוליזה גרימת (היווצרות בועות גז) וגם להרוס את microelectrodes מגדילה באופן משמעותי. הגירה ניתן לעקוב באמצעות התאמת המטוס אנכית של מוקד המיקרוסקופ. אם בוצע כהלכה, MTS יהיה למקם על משטחים אלקטרודה. </li></ol>

<ol>
	<li>Rai-Choudhury, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. , (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הגירה של MTS היא דמיינו בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגלל הבהירות שלהם ואת הקרינה רקע נמוך. השיטה היא בדרך כלל החל על דפוסים biomolecule, כמו זה רק דורש כי ביומולקולות להיגרם לשאת מטען נטו על ידי התאמה של pH מתאים החיץ. Electroosmosis היא להימנע ההתקנה זה כי אין משטחים טעונים ...

מס &#39;1 בורוסיליקט זכוכית coverslips (22 X 50 מ&quot;מ) נרכשו מ VWR. מלוטשים אלקטרוניים כיתה מסוג p &lt;111&gt; פרוסות סיליקון נרכשו מ אדיסון הנדסה, Inc טוהר גבוהה בצבע כסף התקבל מבנה החללית, Inc (קטלוג # 5001 AB). מבודדים מד בסדר חוט נחושת מגנט (~ 0.08 מ&quot;מ (0.003) קוטר) ניתן להשיג מחברות אספקת אלקטרוניים.

antifouling self-assembled monolayers on microelectrodes for patterning biomolecules

אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) (PEG) monolayer trimethoxysilane עצמית התאספו (SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב הייצור בודד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. SAM משמש microelectrodes מעיל עם הדפס ליתוגרפיה רגיל בטון חיובי,. שימוש microtubule כדוגמה, אנחנו מיישמים מתח DC לגרום הגירה electrophoretic אל האלקטרודה SAM מצופה באופן הפיך. תא זרימה משמש הדמיה ההגירה electrophoretic ו דפוסים microtubule<em&gt; באתרו</em&gt; באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. שיטה זו היא בדרך כלל החל על דפוסים biomolecule, כפי שהיא מעסיקה אלקטרופורזה לשתק מולקולות מטרה ולכן אינה דורשת אינטראקציות מולקולריות ספציפיות. יתר על כן, זה ימנע בעיות נתקלים כאשר מנסים דפוס מולקולות SAM ישירות באמצעות טכניקות ליתוגרפיות. תאימות עם קרן אלקטרונים ליתוגרפיה מאפשר בשיטה זו כדי לשמש ביומולקולות דפוס הננומטרי.

Watch this Scientific Journal Video about Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules at JoVE.com

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) עצמית התאספו monolayer (PEG-SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב אחד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. אלקטרופורזה לאחר מכן נעשה שימוש עבור ביומולקולות דפוסים עד הננומטרי.

Antifouling עצמית התאספו monolayers על Microelectrodes עבור ביומולקולות דפוסים

We present a procedure for forming a poly(ethylene glycol) (PEG) trimethoxysilane self-assembled monolayer (SAM) on a silicon substrate with gold ...

antifouling-self-assembled-monolayers-on-microelectrodes-for

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Views.  Texas A&M University (TAMU). אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) עצמית התאספו monolayer (PEG-SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב אחד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. אלקטרופורזה לאחר מכן נעשה שימוש עבור ביומולקולות דפוסים עד הננומטרי.

Video: Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Patterning Cells on Optically Transparent Indium Tin Oxide Electrodes

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular constructs serving as in vitro mimics of native tissues.  In this study, photolithography and wet etching techniques were used to fabricate individually addressable indium tin oxide (ITO) electrodes on glass substrates.  The glass substrates containing ITO microelectrodes were modified with poly(ethylene glycol) (PEG) silane to make them protein and cell resistive.  Presence of insulating PEG molecules on the electrode surface was verified by cyclic voltammetry employing potassium ferricyanide as a redox reporter molecule.  Importantly, the application of reductive potential caused desorption of the PEG layer, resulting in regeneration of the conductive electrode surface and appearance of typical ferricyanide redox peaks.    Application of reductive potential also corresponded to switching of ITO electrode properties from cell non-adhesive to cell-adhesive. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.  Micropatterning of several cell types was demonstrated on these substrates.   In the future, the control of the biointerfacial properties afforded by this method will allow to engineer cellular microenvironments through the assembly of three or more cell types into a precise geometric configuration on an optically transparent substrate.

Non-fouling PEG silane monolayer was desorbed from individually addressable ITO electrodes on glass by application of a reductive potential. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.

דפוסים על תאים שקוף אופטית טין אלקטרודות תחמוצת אינדיום

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

חוכמת חלבון: Workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...