نعترف ميليسا Grunlan للمناقشات مفيدة حول تشكيل SAM. وأيد هذا البحث في جزء من مؤسسة روبرت وولش ألف (A - 1585).

إعداد الكواشف إعداد أنابيب العازلة (أنابيب 80 ملم ، 1MM MgCl 2 ، 1MM EGTA ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 6.8 مع KOH). قسامة وتخزين أوكسيديز الجلوكوز ، والجلوكوز في الكاتلاز -70 درجة مئوية ، والتاكسول على -20 درجة مئوية وفقا للبروتوكولات القائمة. 1،2 قسامة وتويولين المحل في -70 درجة مئوية وفقا للتعليمات التي أدرجها المورد. نمط microelectrodes الاتحاد الافريقي باستخدام الطباعة الحجرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رقائق السليكون الى ركائز 1 سم &quot;1.5 سم به كاتبا أو قطع رقاقة. تنظيف ركائز عن طريق وضعها في كوب مع الأسيتون يكفي لتغطيتها ويصوتن لمدة 5 دقائق. دون السماح للركائز لتجف ، وشطف لهم في الأسيتون الطازجة ، ثم يشطف فورا في الأيزوبروبانول والجافة باستخدام النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال microelectrodes الاتحاد الافريقي على ركائز النظيفة باستخدام معيار ، سواء كان إيجابيا أو لهجة ضوئيه الإلكترون الطباعة الحجرية شعاع ، اعتمادا على حجم من الميزات المطلوبة. 3 عند تصميم نمط الهندسة ، والحفاظ على كل قطرة نمط الكهربائي أقل من 100 ميكرون لضمان التغطية من قبل PEG SAM (وصفها في المقطع التالي). وتشمل منصات الاتصال (~ 300 ملم 2) المتمركزة 300-500 ملم من نمط بخط 1 ملم يربط لوحة مع القطب (الشكل 1). وضع أنماط الطباعة الحجرية بالقرب من منتصف الركيزة للسماح الفضاء حول نمط لتجميع غرفة التدفق. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. هندسة نموذج. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تطوير نمط في طبقة مقاومة ، خط الصفر في مقاومة من منصة اتصال لحافة الركيزة باستخدام الملقط (الشكل 1). عند ترسب المعادن ، وسوف تسمح الصفر الاتصال الكهربائي بين القطب وحافة الركيزة. ويستخدم غرفة الترسيب ، ويفضل أن يكون مع اثنين من المصادر ، على أن تودع طبقة معدنية. وتشكل الأقطاب التي ترسب من 2 نانومتر من الكروم (للالتصاق) ، يليه 6 نانومتر للاتحاد الافريقي ، من دون كسر الفراغ. ويمكن استخدام microbalance الكريستال الكوارتز داخل غرفة مجهزة لقياس سماكة من الأفلام خلال الترسيب. </li></ol> تحضير SAM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتسخين الفرن في منطقة جيدة التهوية إلى 75 درجة مئوية. إعداد الحل silanization بإضافة 20 مل من التولوين إلى الدورق الزجاجي 250 مل. ثم يضاف 1 مل الربط بين سيلاني (أي 5 ٪ V / V) إلى التولوين باستخدام ماصة بلاستيكية. مزيج جيد في الربط بين سيلاني من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 10 مرات ، ثم مع التحريك ماصة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينات منقوشة في الدورق مع الجانب منقوشة تواجه صعودا ، والتأكد من أنها هي غارقة تماما في حل الربط بين سيلاني التولوين ومتباعدة بشكل متساو عبر قاع الكأس. ضع الكأس في الفرن واخبزيها 18-21 ساعة عند 75 درجة مئوية. بينما يتشكل SAM ، وإعداد counterelectrode (أنظر أدناه) ، وتجميع أي مكونات إضافية المطلوبة لتنفيذ الخطوات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 18-21 ساعة في الفرن ، يجب أن تتبخر تاركة التولوين عينات منقوشة في الربط بين بقايا سيلاني اللزجة. إضافة 20 مل من التولوين إلى الدورق ونقع العينات لمدة 1-2 دقائق. إزالة عينات من الدورق وشطف مع التولوين ، ثم الأيزوبروبانول ، والجافة وأخيرا مع النيتروجين. في هذه النقطة ، يجب أن العينات تبدو نظيفة وطبقة ينبغي SAM غير مرئية للعين المجردة. أعد صواريخ سام بهذه الطريقة يمكن استخدامها لمدة تصل إلى يومين عند تخزينها تحت ظروف بارد وجاف (25 درجة مئوية والرطوبة المعتدلة). نتائج ناجحة في تشكيل SAM بقايا طلاء ملون الغائمة أو غير متساو على السطح. </li></ol> يلفقون counterelectrode ترسب في إعداد غرفة نفسها التي استخدمت لترسب microelectrode ، وجعل counterelectrode بإيداع 1 نانومتر من الكروم ، تليها 4 نانومتر للاتحاد الافريقي في الصعود إلى 22 × 50 مم رقم 1 أو رقم ساترة الزجاج 0. ينبغي أن تكون شفافة counterelectrode تقريبا مع صبغة رمادي فاتح أو الوردي. تخزين counterelectrode المغلفة جانب المتابعة في طبق بتري للحفاظ على نظافتها. تتبلمر تويولين إلى MTS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد وغير المسماة تويولين تويولين رودامين والجمع على الفور في نسبة 01:02 المسمى لغير المسماة في الحصول على MTS مشرق. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. وتتبلمر تويولين عن 20-40 دقيقة في حمام ماء ساخن عند 37 درجة مئوية. سوف طول MTS تكون أكبر لأوقات أطول البلمرة. بينما هو تويولين البلمرة ، وإعداد أنابيب العازلة - التاكسول بإضافة التاكسول إلى 20 ملي في أنبوب microcentrifuge تحتوي أنابيب العازلة. مزيج جيد من قبل التاكسول pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات وvortexing ، ثم ضع الأنبوب في حمام ساخن في 37 درجة مئوية. بعد البلمرة ، تمييع MTS بنسبة 100 / 1 في أنابيب العازلة - التاكسول الدافئ والدرعبعيدا عن الضوء. سوف MTS أعدت في هذا السبيل على مر الزمن واستطال حزمة ، والتي يمكن تقليصها من خلال تخفيف أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الأكسجين 10X الكسح (OS) عن طريق الجمع بين 30 مل أنابيب العازلة الباردة (0-4 درجة مئوية) ، و 5 مل من 50 ٪ 2 - المركابتويثانول ، 5 أوكسيديز الجلوكوز مل ، 5 مل الكاتلاز ، و 5 مل من السكر. (2) الجلوكوز وينبغي أن يضاف الماضي. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات بعد إضافة كل عنصر. مكان الخليط OS على الجليد ، وسوف تبقى فعالة لحوالي 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن البلمرة MT كانت ناجحة وأن النظام التجاري المتعدد الأطراف ومستقرة في ظل عدة دقائق من الإثارة التي مضان التصوير MTS أعدت مع مزيج OS 1X. لتصوير النظام التجاري المتعدد الأطراف على استعداد في هذا السبيل ، تأكد من استخدام مزيج الإثارة / الانبعاثات مناسبة لتصفية رودامين مضان. تحديد العمل من أجل التخفيف أفضل شعيرات التصوير الفردية عن طريق تمييع MTS زيادة بنسبة 10 / 1 إلى 1 / 100 باستخدام أنابيب عازلة والتصوير مع مزيج OS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الغرفة التي يقحم تدفق كبير (22 × 50 ملم) والصغيرة ساترة الزجاج (22 × 22 ملم) مع اثنين من قطعة من الشريط على الوجهين وضعت 2-3 مم إربا. يتم قطع الشريط بسهولة إلى شرائح بوضعها على شريحة زجاجية وقطع بشفرة حلاقة. إدخال قليل من microliters MTS في الخلية التدفق باستخدام micropipette. التكبير للتصوير عالية ، قد تكون هناك حاجة أهداف العمل الطويلة المسافة للتصوير السطح العلوي للغرفة التدفق. يتم تحديد المسافة من سطح ساترة / العينة إلى السطح العلوي للغرفة عن طريق تدفق سمك الشريط ، وينبغي 6-10 ملم. </li></ol> نمط MTS باستخدام الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الغرفة الكهربائي عن طريق وضع قطعتين رقيقة من الشريط على الوجهين عبر العينة منقوشة ، SAM المغلفة بحيث الكهربائي بين شرائح الاتصال مع المسار تشغيل عمودي على الشريط (الشكل 2). ضع counterelectrode على الشريط على الوجهين مع الجانب المعادن لمس الشريط بحيث يتدلى حافة العينة التي counterelectrode حوالي 3 ملم (الشكل 2). قطع عدة أطوال 15 سم من الأسلاك النحاسية المعزولة والشريط المغناطيس 1 سم من العزل الخروج من كلا الطرفين. إرفاق سلك الاتحاد الافريقي الى المنطقة المكشوفة من الركيزة باستخدام قطرة صغيرة من الطلاء الفضة مع الحرص على تجنب الوقوع في الاتصال مع counterelectrode الكهربائية (يمكن التحقق من ذلك مع المتعدد). إرفاق السلك الثاني للcounterelectrode باستخدام الطلاء الفضة. ويمكن طلاء الأسلاك المرفقة مع مزيد من الفضة المضمون للعينات مع الشريط. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="الشكل 2" /> تدفق خلية الرقم 2. التجمع من أجل an مضان المجهر المقلوب. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض MTS في التخفيف المطلوب باستخدام أنابيب العازلة جنبا إلى جنب مع نظام التشغيل في تركيز 1X النهائي. الصور 20X في التكبير وتحديد نمط على رقاقة السيليكون قبل تطبيق الجهد. اختياريا ، يمكن اغلاق غرفة تدفق استخدام طلاء الأظافر لمنع تدفق السوائل والهجرة طن متري في الطائرة من غرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الجهد حتى 1 الخامس ومراقبة الهجرة من MTS. ويمكن استخدام أقل الفولتية (وصولا الى نحو 0.5 V) إذا كان هو المطلوب محاصرة عكسها من MTS ، ولكن هذا يتطلب ختم الغرفة لمنع تدفق الانحراف الجانبي. طلاء الأظافر يعمل بشكل جيد لمنع تسرب نهايات مفتوحة للغرفة التدفق. في الفولتية فوق حوالي 0.7 V ، قد شهد بعض التصاق طن متري على نمط ، على الرغم من أنها ستكون ضعيفة. في الفولتية أعلاه نحو 0.9 V ، فإن الهجرة MT يكون أسرع ، والتصاق ستكون أقوى. V 1.2 أعلاه حول احتمال للحمل الكهربائي (تشكيل فقاعة غاز) ، وكذلك عن تدمير microelectrodes بشكل ملحوظ. يمكن تتبع الهجرة عن طريق ضبط الطائرة العمودية التي تركز عليها المجهر. إذا ما نفذت بشكل صحيح ، فإن النظام التجاري المتعدد الأطراف في توطين السطوح الكهربائي. </li></ol>

<ol>
	<li>Rai-Choudhury, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. , (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بسهولة هجرة MTS تصور باستخدام المجهر مضان بسبب لمعانها ومضان خلفية منخفضة. هذه الطريقة تنطبق عموما على الزخرفة جزيء حيوي ، لأنه لا يتطلب سوى أن يكون ذلك حافزا على الجزيئات الحيوية لتحمل شحنة من صافي تسوية مناسبة للدرجة الحموضة عازلة. يتم تجنب Electroosmosis في هذا الإعداد لأ?...

وتم شراء رقم (1) البورسليكات الزجاج coverslips (22 X 50 مم) من VWR. مصقول الالكترونية الصف ف نوع &lt;111&gt; تم شراؤها من شركة رقائق السيليكون أديسون ، هندسة عالية النقاء تم الحصول عليها من شركة الطلاء الفضة الهيكل ، دقق (كتالوج # 5001 AB). ويمكن الحصول على النحاس معزول قياس غرامة سلك المغناطيس (~ 0.08 ملم (0.003) القطر) من شركات التوريد الإلكترونية.

antifouling self-assembled monolayers on microelectrodes for patterning biomolecules

نقدم إجراء لتشكيل بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) trimethoxysilane الذاتي تجميعها أحادي الطبقة (SAM) على ركيزة السيليكون مع microelectrodes الذهب. يتم تشكيل PEG - SAM في خطوة واحدة ويمنع التجمع biofouling على الأسطح السيليكون والذهب. يتم استخدام SAM إلى معطف microelectrodes منقوشة مع معيار الطباعة الحجرية لهجة إيجابية. باستخدام أنيبيب كمثال ، ونحن نطبق الجهد العاصمة للحث على الهجرة إلى القطب الكهربي SAM المغلفة بطريقة عكسية. ويستخدم غرفة للتصوير تدفق الهجرة الكهربي والزخرفة أنيبيب<em&gt; في الموقع</em&gt; epifluorescence باستخدام المجهر. هذه الطريقة تنطبق بصورة عامة على الزخرفة جزيء حيوي ، كما أنها توظف الكهربائي لشل حركة الجزيئات المستهدفة ، وبالتالي لا يتطلب التفاعلات الجزيئية محددة. كذلك ، فإنه يتجنب المشاكل التي تواجهها عند محاولة نمط جزيئات SAM مباشرة باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية. التوافق مع الطباعة الحجرية شعاع الالكترون يسمح استخدام هذا الأسلوب لنمط الجزيئات الحيوية في النانو.

Watch this Scientific Journal Video about Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules at JoVE.com

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

نقدم إجراء لتشكيل البولي (جلايكول الإثيلين) أحادي الطبقة تجميع الذاتي (PEG سام) على ركيزة من السيليكون مع microelectrodes الذهب. يتم تشكيل PEG - SAM في خطوة واحدة ، ويمنع على السطوح biofouling السليكون والذهب. ثم يتم استخدام الجزيئات الحيوية الكهربائي عن الزخرفة وصولا الى النانو.

المانعة الذاتي تجميعها Monolayers على Microelectrodes عن جزيئات حيوية الزخرفه

We present a procedure for forming a poly(ethylene glycol) (PEG) trimethoxysilane self-assembled monolayer (SAM) on a silicon substrate with gold ...

antifouling-self-assembled-monolayers-on-microelectrodes-for

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Views.  Texas A&M University (TAMU). نقدم إجراء لتشكيل البولي (جلايكول الإثيلين) أحادي الطبقة تجميع الذاتي (PEG سام) على ركيزة من السيليكون مع microelectrodes الذهب. يتم تشكيل PEG - SAM في خطوة واحدة ، ويمنع على السطوح biofouling السليكون والذهب. ثم يتم استخدام الجزيئات الحيوية الكهربائي عن الزخرفة وصولا الى النانو.

Video: Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Patterning Cells on Optically Transparent Indium Tin Oxide Electrodes

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular constructs serving as in vitro mimics of native tissues.  In this study, photolithography and wet etching techniques were used to fabricate individually addressable indium tin oxide (ITO) electrodes on glass substrates.  The glass substrates containing ITO microelectrodes were modified with poly(ethylene glycol) (PEG) silane to make them protein and cell resistive.  Presence of insulating PEG molecules on the electrode surface was verified by cyclic voltammetry employing potassium ferricyanide as a redox reporter molecule.  Importantly, the application of reductive potential caused desorption of the PEG layer, resulting in regeneration of the conductive electrode surface and appearance of typical ferricyanide redox peaks.    Application of reductive potential also corresponded to switching of ITO electrode properties from cell non-adhesive to cell-adhesive. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.  Micropatterning of several cell types was demonstrated on these substrates.   In the future, the control of the biointerfacial properties afforded by this method will allow to engineer cellular microenvironments through the assembly of three or more cell types into a precise geometric configuration on an optically transparent substrate.

Non-fouling PEG silane monolayer was desorbed from individually addressable ITO electrodes on glass by application of a reductive potential. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.

الزخرفة على خلايا شفافة بصريا أقطاب إنديوم أكسيد القصدير

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

الزخرفة من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام رقاقة بيو فليب

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

الحكمة البروتين: A منضدة لل<em&gt; في السيليكون</em&gt;<em&gt; دي نوفو</em&gt; تصميم الجزيئات الحيوية

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

استيعاب ومراقبة من نيون جزيئات حيوية في الكائنات الدقيقة الحية عبر Electroporation لل

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA-β-Galactosidase القائم على فحص الفحص لتحديد الأدوية Senotherapeutic

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...