1. תכנות מחדש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב&quot;ג Seed תאים בצפיפות של 1 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 6 באר. התרבות התאים 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול (450 מ&quot;ל EMEM בתוספת 50 מ&quot;ל ES FBS מוסמך, 5 מ&quot;ל 10 mM שאינם חיוניים חומצות אמינו, 5 מ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ&quot;ל 200 מ&quot;מ L-גלוטמין ו - 0.9 ml 55 β mM -mercaptoethanol) לילה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום, להתחיל בהכנת צלחות MEF מזין ידי הוספת 0.1% ג&#39;לטין מדולל במים לצלחת 6 היטב דוגרים לילה בשעה 37 ° C ו-CO 2 של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להסיר בינוני מתאי ב&quot;ג ומוסיפים 2 מ&quot;ל צמיחה בינוני בתוספת 6 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של polybrene, 500 μl hOct4-lentivirus, 50 μl hSox2-lentivirus, 50 μl hNanog-lentivirus ו 50 μl hLin28-lentivirus זה טוב . רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ציפוי אפילו של המדיום. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום, להסיר 1 בקבוקון של תאים CF-1 MEF מ חנקן נוזלי ההפשרה. הסרת נוזל מבארות מצופה ג&#39;לטין (ראה שלב 1.2) ולהוסיף מזין תאים MEF בצפיפות של 0.2 x 10 5 תאים / היטב. ההיקף הכולל לכל טוב צריך להיות 2ml של תאים במדיום הגידול MEF (450 מ&quot;ל DMEM בתוספת 50 מ&quot;ל ו 5 מ&quot;ל FBS שאינם חיוניים חומצות אמינו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לנתק תאים ב&quot;ג עם 0.05% טריפסין / EDTA ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב הבינוני resuspend במדיום הגידול. הסר בינוני מהצלחת מזין MEF (ראה שלב 1.4) ומוסיפים 2 מ&quot;ל / היטב ההשעיה תא ב&quot;ג. ריכוז התאים יש כ 5 x 10 4 תאים / היטב. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני 24 שעות לאחר זריעה מחדש עם אדם בינוני ES / תא iPS תרבות (400 מ&quot;ל DMEM/F12 בתוספת החלפת נוק סרום 100 מ&quot;ל, 10 מ&quot;ל 5 שאינם חיוניים mM חומצות אמינו, 5 מ&quot;ל 200 מ&quot;מ L-גלוטמין, 0.9 מ&quot;ל 55 מ&quot;מ ו - β-mercaptoethanol 20 ng / ml bFGF רקומביננטי אנושי). שנה בינונית כל 24 שעות למשך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבעה ימים, לשנות בינוני עד בינוני MEF מותנה (ראה סעיף 2). </li></ol> 2. הכנת בינוני MEF אילף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים CF-1 מזין MEF תאים ב 2 x 10 5 תאים / גם בצלחת 6 באר בינוני 2 הצמיחה MEF מ&quot;ל. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בינוני עד בינוני אדם ES / iPS תרבית תאים. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant כל 24 שעות במשך ארבעה ימים. סינון supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף supernatant עם 50 ng / ml של bFGF. </li></ol> 3. iPS לבחירה קולוני ו Passaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר המושבה ES-כמו מחדש זרע בינוני ES / iPS האדם תרבות בתוספת של 10 מיקרומטר Stemolecule Y27632 על התרבות תאים טרום מנות זרע עם CF-1 תאים מזין MEF. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התרבות בינוני כל 24 שעות למשך שבעת הימים הראשונים (בלי להשלים עם Stemolecule Y27632). לאחר שבעה ימים, לשנות בינוני עד בינוני MEF מותנה (ראה סעיף 2 להכנת). המשכנו passaging התאים עד שהם הראו ES טיפוסי מורפולוגיה האדם. </li></ol> 4. בחינת Immunocytochemical של סמנים pluripotency <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 500 μl של מקבע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 500 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 250 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי לילה ב 4 ° C (השתמשנו tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog ו Lin28 בשעה 1:100 דילולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 250 μl של נוגדנים משני שעה 1 בטמפרטורת החדר, שמירה מן האור (השתמשנו עיזים אנטי עכבר IgM Cy3 המצומד, עיזים אנטי עכבר IgG Cy3 המצומד, אנטי עכברוש עיזים IgM Cy3 המצומד ו עיזים אנטי הארנב Cy3 המצומד בשעה 1:300 דילולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI (הריכוז הסופי 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לשטוף האחרון דגירה 5 דקות כדי להמחיש גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים בהגדלה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג 1. מורפולוגיה תוצאות: האדם פיברובלסטים העורלה (ב&quot;ג) היו תאים שיתוף transduced עם Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. שינויים מורפולוגיים נצפו כבר ביום שלאחר 4 התמרה, ואת מקבץ של תאים נהיו יותר צפופים בכל יום 17 (איור 1). מושבות נבחרו באופן ידני בכל יום 25 ותרבותי על CF-1 תאים MEF מזין. כדי להקל את המושבה תא iPS היווצרות לאחר תכנות מחדש, השתמשנו Stemolecule Y27632, מעכב רוק, על זריעת לילה ראשונית במהלך כל קטע. מושבות iPS תא עם מורפולוגיה טובה נצפו לאחר שלושה סיבובים רציפים של המושבה קטיף ואת passaging. 2. הביטוי של סמנים pluripotency: כדי להמשיך ולאפיין את iPS מושבות תאים מבודדים, חיפשנו נוכחותם של סמנים pluripotency המשותף לידי ביטוי בתאי גזע עובריים. מושבות הציג חזק phosphatase אלקליין (AP) פעילות (איור 2). בנוסף, immunocytochemistry (ICC) בוצע על מושבות תאים iPS עם פאנל של נוגדנים ספציפיים סמן pluripotency, כולל סמנים משטח tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4 ו SSEA-3, כמו גם סמנים גרעיני Oct4, Sox2 ו Nanog. מושבות מבודדות iPS היו חיוביות עבור כל הסמנים (איור 3). תוצאות ICC מראים כי תאים iPS הציג את הביטוי המתאים pluripotency דפוס סמן, הוכחת כי תאים אלה iPS דומים שלא עברו התמיינות תאים עובריים אנושיים. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: שינויים מורפולוגיים של transduced תאים ב&quot;ג. תמונות שדה מוארת של מושבה iPS טיפוסי תא נוצר ב (א) 4 ימים (ב) התמרה שלאחר 17 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: איי פי הפעילות של תאים ב&quot;ג reprogrammed. שלוש מושבות שונות מוכתם Stemgent ערכת phosphatase אלקליין מכתים. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: אדם בתאי iPS להביע רמות גבוהות של התא הבא ES סמנים ספציפיים: סמנים משטח tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4 ו SSEA-3, ו סמנים גרעיני אוקטובר 4, Nanog ו Sox2.

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (1917).</li><li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Rho/ROCK+pathway+reduces+apoptosis+during+transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors.">Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors.</a> J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).</li></ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי Stemgent המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

תוצאות אלו מראות כי הגדר Stemgent האדם TF Lentivirus ניתן להשתמש ביעילות ליצור מושבות iPS ידי גרימת ביטוי אקטופי של transduced גורמי שעתוק ב fibroblasts האדם. בעת תכנון ניסויים תכנות מחדש, כמה משתנים צריך להיחשב כדי לייעל את היעילות של תכנות מחדש. ראשית, יחס פעיל וירוס אל היעד (ריבוי הפנים של זיהום) ייתכן שיהיה צורך לשנות במהלך השלב הראשוני התמרה התמרה כדי להשיג יעילות אופטימלית. שנית, בתנאי הגידול של התאים היעד יכול להשפיע על תכנות מחדש. תאים בריאים שגשוג הנוחות יותר תכנות מחדש. שלישית, כאשר משנים את הפרוטוקול למספרים תאים שונים, מומלץ כי התא מספרי היעד להיות מותאם באופן יחסי על פני השטח של המנה תרבות. לבסוף, מעכבי ROCK יישום כגון Y27632 צריך להיחשב כדי להבטיח reprogramming מוצלח כמו מחקרים שנעשו לאחרונה הראו השירות שלה בהישרדות הס שיפור המושבה. 4,5

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human TF Lentivirus Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>00-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stemolecule Y27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRA-1-81 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>09-0012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRA-1-60 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>09-0009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>09-0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-3 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>09-0014</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of induced pluripotent stem cells by reprogramming human fibroblasts with the stemgent human tf lentivirus set

בשנת 2006, יאמאנאקה ועמיתיו הוכיחו הראשון רטרווירוס בתיווך מסירה ביטוי Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4 מסוגל גרימת המדינה pluripotent ב fibroblasts העכבר. 1 אותה קבוצה גם דיווחו על תכנות מחדש מוצלח של אדם לתוך תאים סומטיים המושרה גזע pluripotent (IPS) תאים באמצעות גירסאות האדם של גורמי תעתוק אותו מועברים על ידי וקטורים retroviral. 2 בנוסף, ג&#39;יימס תומסון et al. דיווחו כי lentivirus בתיווך שיתוף הביטוי של קבוצה נוספת של גורמים (Oct4, Sox2, Nanog ו Lin28 ) היה מסוגל reprogramming האדם תאים סומטיים לתאי iPS 3. תאים iPS דומים לתאי גזע עובריים בהפצה מורפולוגיה, ואת היכולת להתמיין לכל סוגי הרקמות בגוף. האדם תאים iPS יש יתרון בולט על פני תאים ES כפי שהם מציגים תכונות מפתח של תאים ES ללא הדילמה האתית של הרס העובר. הדור של מטופל ספציפי בתאי iPS עוקף מחסום חשוב אישית טיפולים רפואה רגנרטיבית ידי ביטול פוטנציאל דחייה של מערכת החיסון הלא עצמיים התאים המושתלים. כאן אנו מדגימים את פרוטוקול תכנות מחדש תאים פיברובלסטים אנושי באמצעות הגדרת Stemgent האדם TF Lentivirus. כמו כן, אנו מראים כי תאים reprogrammed עם סט זה מתחיל להראות iPS מורפולוגיה ארבעה ימים לאחר התמרה. שימוש Y27632 Stemolecule, בחרנו עבור תאים iPS ומורפולוגיה לתקן נצפה לאחר שלושה סיבובים רציפים של המושבה קטיף ואת passaging. כמו כן, אנו מראים כי תאים לאחר תכנות מחדש מוצגת בסמן AP pluripotency, סמנים משטח tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4 ו SSEA-3, ו סמנים גרעיני Oct4, Sox2 ו Nanog.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set at JoVE.com

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-reprogramming-human

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

29.7K Views.  Stemgent. אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

Video: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...