1. תחזוקה: תרבויות התבוננות במיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת אחת של תאים הס מ 37 ° C החממה ומביאים המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב המושבות בהספק נמוך, באמצעות הגדלה 2X או 5X, כדי להעריך את איכות התרבות הכללית. הערה הבאות: צבע בינוני רגיל, העדר זיהום, גלויה, גודל המושבה הכוללת, איכות וצפיפות, וכל תצפיות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב שינויי צבע בינוני. עקב שינוי ב-pH ואת דלדול של חומרים מזינים במדיום לאחר הדגירה לילה עם תאים הס, המדיום ישתנה מ גוון אדום צבע &quot;קש&quot;. אם המדיום מופיע סגול, שינוי pH בסיסי התרחשה. אם המדיום נראה צהוב מאוד, בינוני יש acidified. צהוב בינוני מאוד יכול להיות תוצאה של מושבות צפופות מאוד טוב או זיהום. המדיום אמור להופיע ברור בכל עת. למרות רמה מסוימת של פסולת תא המדיום הוא נורמלי, זה לא אמור להופיע מעונן. אם רמה גבוהה של פסולת התא הוא ציין, התרבות אינו בריא ועלול להיות מזוהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרבויות אינן דורשות תחזוקה או passaging, הם יכולים להיות נלקח ארון הבטיחות הביולוגית להיות מוזן (ראה סעיף 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התרבויות להכיל יותר מ כ -10% המבדילים מושבות, התאים יש &quot;לנקות&quot; באופן ידני על ידי הסרת אזורים מובחנים (ראה סעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרבויות מכילות מושבות גדולות או צפוף, או את השכבה מזין MEF הוא יותר מ 12 ימים, התאים צריכים להיות passaged (ראה סעיף 4). </li></ol> 2. האכלה הס תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות סטרילי ביולוגי, להסיר את המכסה של המנה תרבות לשאוב את המדיום בילו. אין לאפשר את קצה פיפטה לגעת באף חלק של צלחת אחר מאשר ישירות בתוך הבארות. אם יש חשש של זיהום, שינוי פיפטה חדשה, סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet זכוכית סטרילית, להוסיף את הכמות המתאימה של תרבות חימם בינוני הס התא היטב כל אחד. עבור תרבויות בצלחת 6-היטב, מוסיפים 2.5 מ&quot;ל לכל מדיום היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את הצלחת אל האינקובטור להישאר 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. הסרת דיפרנציאציה בין תרבויות הס Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה 9 אינץ&#39; זכוכית פסטר pipettes לכלי לקטוף ידי עטרה טיפים על אש מבוקרת של אלכוהול צורב. וודאו כי קצה פיפטה אטום על מנת למנוע זיהום מעוגלות להימנע מגרד את הפלסטיק של המנה תרבות. לעקר את הכלים קטיף לפני השימוש באמצעות מקור אור UV בממשלה בטיחות ביולוגית או לקטוף המתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אזורים מובחנים. בידול מתרחשת לעתים קרובות רק בחלק של המושבה תא הס, בדרך כלל בשוליים או כתמים בודדים במרכז. אם רק קטע של מושבה הוא מבדל, רק באזור מובחן צריך להסירו. בידול יכול לעיתים קרובות להרים את צלחת גיליון &quot;דביקות&quot;, וזה מועיל קודם להפריד את התאים מובחן משאר המושבה על ידי ציור קו באמצעות המושבה עם סוף הכלי קטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתיכות של המושבה מופרדים, להחליק בעדינות את הכלי לקטוף לאורך הצלחת לנתק את תאים לא רצויים. יש להיזהר שלא לגרד יותר מדי שכבת מזין MEF בין המושבות בתהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים הבדיל יוסרו מן הצלחת (וגם צף בינוני), להחזיר את התרבות לממשלה בטיחות ביולוגית. לשאוב את המדיום המכיל תאים מבודל להחליף עם תרבות טרי בינוני הס התא. </li></ol> 4. Passaging הס תאים אנזימים דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות סטרילי ביולוגי, להסיר את המכסה של צלחת 6-היטב את התרבות לשאוב את המדיום בילה מבארות להיות passaged. אין לאפשר את קצה פיפטה לגעת באף חלק של צלחת אחר מאשר ישירות בתוך הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet זכוכית סטרילית, מוסיפים 1 מ&quot;ל של חימם collagenase IV זה טוב להיות passaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את הצלחת עד 37 ° C החממה במשך 5 דקות. </li></ol> אוספות ואיגום תאים הס <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דוגרים התאים עם collagenase, לקיים את המושבות תחת המיקרוסקופ. האנזים צריך לגרום לשינוי עדין אך נצפות את הקצוות המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, לשאוב בעדינות את האנזים מבאר כל ולהחליף 2.0 בינוני מ&quot;ל הס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצה את הצלחת תרבות מעט כלפי לך לקחת את המדיום mL 2.0 היטב הראשונה עם pipet זכוכית 5 מ&quot;ל. החזקת בניצב pipet לחלק התחתון של הצלחת, להחליק בעדינות את קצה pipet ברחבי היטב תוך לאט משחררים את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על גירוד pipetting תנועה 3-4 פעמים עד שכל המושבות הוסרו מן הבאר. Pipet בעדינות כדי למנוע פירוק המושבות לתוך חתיכות קטנות מדי. כאשר התאים הוסרו מן הבאר הראשונה, לעזוב את תוכנו של טוב להתחיל מגרדים תאים מעל הבא היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל בארות להיות passaged כבר מגורד, הבריכה בינוני המכיל את חלקי המושבה מבאר כל שפופרת 15 מ&quot;ל סטרילי חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבארות מגורד על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות הס התא היטב כל אחד. איסוף זה לשטוף להעביר צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet התאים בעדינות בצינור כדי לשבור את השברים מושבת עד לגודל הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות בשעה 200 x ז </li></ol> ציפוי תאים תאים הס <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד תאים הס הם בצנטריפוגה, להכין צלחת חדש 6-MEF גם מזין. לייבל את הצלחת עם המידע המתאים הס התא: שורת תאים, מספר קטע חדש, תאריך המעבר. לשאוב את המדיום MEF מבארות ומוסיפים 1.0 מ&quot;ל PBS היטב כל אחד. בעדינות מערבולת החיץ סביב בארות לשאוב לשטוף PBS. הוסף 1.5 מ&quot;ל הס תרבות בינוני התא היטב כל להגדיר את הצלחת בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הס שתסיים centrifuging, להביא את הצינור בחזרה לארון בטיחות ביולוגית. לשאוב supernatant, נזהר לא להפריע רופף וגדוש תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים את הכדור עם מדיום מספיק בינוני 1 מ&quot;ל הס תא תרבות לכל גם להיות מצופה. כאשר פיצול 6 בארות חדשות, resuspend גלולה בינוני 6 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות ובאופן שווה להוסיף 1 מ&quot;ל של ההשעיה תא אחד מוכן היטב הצלחת מזין MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C חממה בזהירות את הצלחת להחליק קדימה אחורה, מצד לצד כדי לפזר באופן שווה את התאים לאורך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף בשעה 37 ° C במשך הלילה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: מובחן תאים הס הם קטנים, ארוז היטב, ובדרך כלל כוללים התפשטות גדול יותר, יותר מחוץ לתאים. בידול יכול להתרחש בתוך מושבה (איור 1A) או בין מושבות (איור 3B). Morhopologies שונים ניתן לראות בהגדלה נמוכה מתחת למיקרוסקופ. מורפולוגיה תא טוב, כפי שניתן לראות בתרשים 2A, מכיל קטן, תאים צפופים הצומחים בשכבה. תאים צריך להיות נקי, קצוות מוגדרים, עם מעט בידול לא. התאים שמוצג באיור 2B מוכנים passaging, והתאים שמוצג באיור 2C הם צפופים. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בידול בתרבויות הס. (א) הבחנה של מושבה (ב) הבחנה בין המושבות. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מורפולוגיות לראות תרבויות הס. (א) מורפולוגיה תא טובה (ב) תאים הס כי הם מוכנים passaging (ג) בתאים צפופים.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

עקרות חייבת להישמר בכל עת כאשר עובדים עם תאים הס. נקו לעקר את ארון הבטיחות הביולוגית וכל הציוד לפני השימוש. ריאגנטים כל חייב להיות מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר גודל הנקבוביות לפני השימוש. השימוש antiboiotics התרבות תאים הס אין צורך יש להימנע. סביבה נפרדת יש להגדיר כתחנת איסוף ייעודיים. מתחם סטרילי לתחנת יכול להיות המתחם סטטי (כגון תחנת עבודה PCR) עם מקור אור UV, ברדס זרימה למינרית, או ארון בטיחות ביולוגית. מיקרוסקופ לנתח בתוך תחנת קטיף יש צורך לבחון את מושבות כמו אזורים מובחנים יוסרו. הזכוכית בלוח הקדמי של המתחם סטטי או ארון בטיחות ביולוגית חייבת להיות שונה, כדי לאפשר oculars של המיקרוסקופ להאריך דרך לוח בלי להתפשר על זרימת האוויר עקרות נכונה. כדי לשמור על בריאות תרבויות הס תאים, התאים חייבים להיות passaged בזמן האופטימלי, בדרך כלל כל 4-7 ימים. בשלב זה המושבות הגיעו הגודל המרבי שלהם עשוי להיות תחילת למזג. מושבות שמוזגו יכול להגביר את קצב בידול בתרבות. יחס פיצול בדרך כלל בסתיו 1:03-01:05, תלוי במספר מושבות מצופה, קצב התפשטות, והתנאים תרבות. מושבות Overplated (יחס הפיצול נמוך מדי) צפויה להתמזג בטרם עת צריך להיות passaged לפני שהם מגיעים לגודל המקסימלי שלהם. תרבויות על שכבת מזין MEF כי הוא יותר מ 2 שבועות חייב להיות passaged על חדש MEFs כי יתמכו בצמיחה התפשטות מובחן. מאז בידול באופן טבעי מתרחש בתרבויות הס סלולריים, כמות קטנה צפוי. בידול תכופה או מופרזת עלולה להתרחש אם תרבויות אינם מקבלים טיפול הולם. התאים חייב להיות מוזן כל יום, בין יתר הקטעים יש להימנע. השתמש תמיד ריאגנטים טריים. כל כלי התקשורת MEFs ו ריאגנטים יש להשתמש תוך 14 יום, כדי למנוע צמיחה מובחן הס התא. הרבה חדש של חומרים כימיים, כגון החלפת נוק סרום, FBS ו MEFs, צריכים להיבדק לפני השימוש. זכרו כי כל התאים הבדיל לא הוסרו לפני passaging יועברו תרבויות חדשות. כמו כן, מנסה לשמור על התאים ב 37 ° C אפשרי בכל עת. מזער את זמן התאים לבלות מחוץ החממה (למשל על הבמה מיקרוסקופ או בארון בטיחות ביולוגית.) שלב מיקרוסקופ מחומם יכול להיות מועיל מאוד אם התאים יהיו בחממה במשך פרקי זמן ארוכים. כאשר התבוננות בתרביות תאים הס מתחת למיקרוסקופ, תחילה להעריך את איכות הגודל הכולל של המושבות להציג באמצעות כוח אובייקטיבי נמוך (2x או 5x). אם התאים הבדיל פוטנציאלי הם נצפו על צריכת חשמל נמוכה, לאשר את המורפולוגיה מובחן באמצעות המטרה הגדלה גבוהה (10X). מיד לאחר הוצאת הבידול, את הקצוות של מושבות עשוי להופיע משוננת או פגום. דגירה למושבות לילה בינוני טרי לאפשר תאים שלא עברו התמיינות הנותרים להתאושש. ללא השפעת הבידול בתרבות, אלו מושבות הנותרים ימשיכו להתרבות כרגיל. במידת האפשר, להתחיל ניסויים באמצעות מעבר נמוך תאים הס. קריוטיפ התאים לפני ואחרי כל הניסויים העיקריים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

האדם גזע עובריים (הס) התאים חייבים להיות במעקב ומטופל על מנת לשמור על בריאות, תרבויות מובחן. לכל הפחות, תרבויות חייב להיות מוזן בכל יום על ידי ביצוע שינוי בינוני להשלים לחדש מזינים אבוד לשמור על תרבויות ללא בידול גורמים לא רצויים. למרות כמות קטנה של בידול הוא נורמלי וצפוי בתרביות תאים גזע, תרבות יש לנקות באופן שגרתי על ידי הסרת ידני, או &quot;לקטוף&quot; אזורים מובחנים. זיהוי והסרה של בידול עודף מתרבויות הס תא טכניקות חיוני בשמירה על אוכלוסיה בריאה של תאים.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.5K Views.  Stemgent. פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

Video: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...