עבודה זו מומנה על ידי מחלקת הביטחון של עידן פרס המלומד התקווה (מס &#39;W81XWH-05-0396) וכן חוקר Pew פרס למדעי ביו אדוארד בראון ב III.

1. יישר את אופטיקה. הציוד מפתח עבור הניסוי MP-FRAP כוללים: מצב נעול מקור לייזר, Pockels Cell (עבור קרן אפנון), דופק גנרטור, dichroic, עדשה אובייקטיבי, מסנן הקרינה פליטה, צינור מכפיל סגורות, ומערכת נתונים הקלטה (פוטון לדלפק ואת רב Scaler). 2. קביעת סמכויות לפקח על בטוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליש את הלייזר לשלטון, נמוך, אבל סביר להפקת הקרינה בתוך המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס בתוך המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מונה פוטון לשלב מעל ציר הזמן הרבה יותר מאשר ההתאוששות הקרינה הצפויה. עם נפח מוקד שנערך נייח בתוך המדגם (על תוכנת מיקרוסקופ שלנו זו מושגת על ידי סריקה נקודה), שיא מספר סביר של נתונים לספור פוטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את הכוח לקחת סדרה נוספת של נתונים פוטון לספור. חזור על הפעולה עד העלייה ספירת פוטון נראה להפחית באופן משמעותי ביחס להגדיל את כוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש יומן (ספירת פוטון) כפונקציה של log (כוח). סטייה מדרון של שני מצביע על הלבנת במהלך לצג. בחר ככוח לצג עוצמה נמוכה זה לחתוך, אבל המאפשרת אות סביר יחס רעש. </li></ol> 3. קביעת פרמטרים של קלט כדי הגנרטור הדופק רב Scaler. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע בחזרה-of-the-המעטפה הערכות של מקדם הדיפוזיה וזמן ההתאוששות מבוסס על ספרות / או את משוואת סטוקס-איינשטיין את המשוואה דיפוזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ערכי הפרמטרים הדרושים על מחולל את הדופק ואת Scaler. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מחולל את הדופק, לקבוע את הזמנים מראש אקונומיקה אקונומיקה. קבוצה טובה של כללי אצבע הוא כי אקונומיקה מראש צריך להיות 1-2 פעמים גדול יותר הפעם צפויה התאוששות וחצי, הזמן אקונומיקה צריך להיות עשירית הזמן הצפוי להתאוששות וחצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על Scaler, להגדיר את רוחב בן כ משך one חצי אקונומיקה, ולהגדיר את מספר פחי לכל רשומה כזו, כי המוצר של רוחב בן שבחרת פחי לכל רשומה הוא גדול או שווה בקירוב התאוששות מלאה צפויה שלך פלוס מראש -אקונומיקה אקונומיקה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל הגנרטור דופק ולקבוע את תדירות רצף pre-bleach/bleach/monitor שווה ערך רק קטן יותר מאשר הפוך המוצר של רוחב פעמים בן מספר פחי לכל רשומה. * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להגדיר את מספר הרשומות / סריקה על Scaler המבוסס על עוצמת האות בכל הכוח שבחרת לפקח. * חשוב מאוד כי זמן ברצף pre-bleach/bleach/monitor מלאה (1/frequency) מוגדר על הגנרטור הדופק עולה בזמן איסוף הנתונים (רוחב x פחי bin / שיא) מוגדר על Scaler. אם זה הקריטריונים לא מתקיים, מעורר אקונומיקה מרובים עשוי להופיע בתוך הרשומה יחיד על Scaler. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הכוח לפקח לרמה מקובלת, נקבע קודם לכן. הגדר את כוח אקונומיקה כדי mW 200 או כך מעל הפסקת הלבנה נקבע במהלך הבדיקה לנטר הלבנה. סמכויות אלה הן כמפורט במתחים שונים ברחבי גביש ה-PC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את המיקרוסקופ, לכבות את האורות, להדליק PMT, להתחיל לסרוק נקודה על תוכנת מיקרוסקופ, ולאחר מכן להפעיל את גנרטור הדופק Scaler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח עקומת התאוששות וכתוצאה מכך על ידי התוויית עקומת וסימון שלוש נקודות חשובות: 1) את הקרינה מראש אקונומיקה, 2) את הקרינה מיד לאחר אקונומיקה, ו 3) את הקרינה בסוף ערכת הנתונים. השתמש ערכי הקרינה מראש ומיד לאחר אקונומיקה כדי להעריך טוב יותר את זמן מחצית התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הערכה זו של זמן מחצית ההתאוששות, השתמש כללי אצבע שתוארו קודם לכן כדי לקבוע ערכים חדשים עבור אקונומיקה, טרום אקונומיקה, ורוחב המשכים סל. כמו כן, השימוש הקרינה מראש אקונומיקה הקרינה בסוף הנתונים מוגדר טוב יותר להעריך את הזמן הנדרש כדי להשיג החלמה מלאה. ככלל אצבע, יש לאסוף נתונים עבור פרק זמן המאפשר התאוששות מלאה ידווחו על המחצית השנייה של הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הפרמטרים על גנרטור הדופק Scaler, לקחת עקומת חדש, ולהמשיך tweaking את הפרמטרים עד עקומת שלך תערוכות אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה. זכור כי משך אקונומיקה יכול, וצריך, להיות מופחת מתחת שלטונו של האגודל, אם אפשר. הכוח אקונומיקה עשוי גם להיות מותאם אם רדוד מדי או עמוק מדי, אקונומיקה מושגת. </li></ol> 4. מבחן הרוויה עירור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צג המתאים סמכויות אקונומיקה, נקבע בעבר, לנקוט שורה של MP-FRAP עקומות. ניתוח כל התאוששות, מנורמל ל פלואורסצנציה מראש אקונומיקה, באמצעות טופס מתמטיים מתאימים שאינו ליניארי הריבועים הפחותים אלגוריתם מתאים (ראה &quot;ניתוח נתונים&quot; להלן). הקלט את הערך של הפרמטר מצויד עומק אקונומיקה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך נטילת וניתוח סדרת רצופים של MP-FRAP עקומות להגדיל את הערכים של כוח אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש יומן (עומק פרמטר אקונומיקה) כפונקציה של log (כוח). כל סטייה מן המדרון של שני מציין הרוויה עירור. בחר כוח אקונומיקה כי התשואות אקונומיקה חזקה, אבל אינו גורם הרוויה. </li></ol> 5. המשך נטילת MP-FRAP עקומות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לקחת את הקימורים, כאמור לעיל, כל הפרמטרים יהיה להגדיר כראוי. </li></ol> 6. ניתוח נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנתונים מראש אקונומיקה אקונומיקה מהנתונים הקרינה להגדיר ולהתאים את הנתונים בזמן כזה t = 0 המתאים לערך הקרינה מיד לאחר אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל את ההתאוששות הקרינה וכתוצאה מכך לגבי הקרינה מראש אקונומיקה הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאימו את עקומת מנורמל באמצעות מודל מתמטי מתאים אלגוריתם שאינו ליניארי, הריבועים הולם, כגון תפקוד lsqcurvefit ב MATLAB. המודל המוצג כאן מהווה החלמה הקרינה מושפעת דיפוזיה וגם זרם הסעה: <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="משוואה" /> היכן F o היא הקרינה מראש אקונומיקה הממוצע, β הוא פרמטר עומק אקונומיקה, τ D הוא הזמן האופייני התאוששות diffusive, R הוא היחס בין הכיכר של צירית (w z) כדי רדיאלי (w r) רוחבי של נפח מוקד שני הפוטונים, τ VX r = w / v x, τ VY = w r / v y, τ VZ = w z / v z, ו v 2 v = x 2 + v y 2 + z v 2 הוא מהירות הזרימה הסעה. עבור זרימה מוגבלת המטוס הדמיה, τ VZ → ∞ ו 1 / τ VX + 1 / τ VY ניתן להחליף 1 / τ VR. בהעדר זרימת הסעה, הן exponentials במונה ללכת 1 והביטוי מצטמצם מאוד, רק שני פרמטרים מתאימים, β ו - τ ד. מקדם דיפוזיה מחושב בקלות D = w r 2 / 8τ ד. </li></ol> 7. נציג תוצאות. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. אקונומיקה ייצוגית עקומת התאוששות עבור FITC-BSA. עקומת התאוששות טובה תערוכות אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה, עם הקרינה בבית החלמה מלאה שדווח עבור המחצית השנייה של הנתונים. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. עקומת התאוששות מנורמל עבור FITC-BSA (אדום) ואת בכושר הקשורים הפחות ריבועים (שחור). התאמה זו התשואות מקדם דיפוזיה של 52.9 um2 / s, עולה בקנה אחד עם הספרות.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li><li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo.">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li></ol>

כוחה של התאוששות רב פוטון הקרינה לאחר photobleaching טמון ביכולתה לחקור דגימות עבה עם רזולוציה 3D. מאז הפיתוח שלה של 1990, MP-FRAP נעשה שימוש כדי לקבוע את מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) בגוף התא, לשעבר פרוסות vivo רקמה עבה, ברקמות interstitium vivo ו. במאמר זה, הצגנו את הציוד הדרוש להפעלת ניסוי MP-FRAP, כמו גם את ההליך המתאים יישור נתיב קרן, קביעת פרמטרים ניסיוניים, לקיחת נתונים, שחזור וניתוח עקומות. האפשרויות של גל עירור מתאים מסנן פליטה צריך להיות מונחה על ידי שני הפוטונים חתכים ואת ספקטרום הפליטה. מידע זה נכלל לעתים קרובות עם הנתונים הטכניים צבעים שונים. בנוסף, יישור קרן הלייזר, חשוב שגדשו תקין של העדשה האחורית של המטרה להיות מושגת. מטרה זו מושגת בדרך כלל על ידי הוספת expander קרן במערכת אופטית. שגדשו פרופר ניתן לאמת על ידי רזולוציית סריקה תת חרוזי ניאון קבוע בשני הכיוונים צירית לבין רדיאלי ואז בקשירת קשר והתאמת פרופילי פלואורסצנטי Gaussians כדי למצוא את 1 / e 2 רוחבי להשוואה עם ערכי הספרות. חשוב גם לבחור ניטור הולם סמכויות הלבנה. הכוח להשתמש כדי לפקח על הקרינה טרום ופוסט אקונומיקה צריכה להיות נמוכה מספיק כדי לא לגרום ניכר הלבנה, אבל גבוהה מספיק כדי לאפשר יחס אות לרעש טוב. הכוח הלבנת להימנע הרוויה עירור. בניסוי MP-FRAP יש גבול עליון לשיעור עירור הקרינה, אשר עומד ביחס לכיכר האירוע כוח על המדגם. גבול זה מסמן את תחילתה של המשטר הרוויה עירור. עקומות התאוששות Fluorescence הופק באמצעות כוחות אקונומיקה ההפעלה במשטר הרוויה עירור תניב מקדמי דיפוזיה נמוכה בטעות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ti:sapphire laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra Physics</td>
<td>Mai Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Conoptics</td>
<td>350-80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Scanning Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Fluoview</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Short pass dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma Technologies</td>
<td>670 DCSX-2P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photon counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multi-channel scaler/averager</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>DG 535</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITC-BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>--</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching

Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching היא טכניקה מיקרוסקופיה למדידת מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) של מקרומולקולות, והוא יכול להיות מיושם גם<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt; מערכות ביולוגיות. Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching מבוצע על ידי photobleaching אזור של אינטרס בתוך מדגם ניאון באמצעות הבזק לייזר אינטנסיבי, ולאחר מכן משפשפים את הקורה ואת ניטור הקרינה כפי עדיין פלורסנט מולקולות מחוץ לאזור של מפוזר עניין להחליף את מולקולות photobleached . נתחיל ההפגנה שלנו על ידי יישור קרן לייזר דרך התא Pockels (לייזר אפנן) ו לאורך השביל אופטי באמצעות תיבת לייזר לסרוק העדשה אובייקטיבי המדגם. לשם הפשטות, נשתמש דגימה של צבע פלואורסצנטי מימית. לאחר מכן, לקבוע את הפרמטרים של הניסוי מתאים המדגם שלנו כולל, לפקח סמכויות הלבנה, משך אקונומיקה, רוחב סל (עבור ספירת פוטון), וזמן ההתאוששות פלואורסצנטי. לאחר מכן, נתאר את הליך נטילת עקומות התאוששות, תהליך זה יכול להיות אוטומטי במידה רבה את התפוקה משופר באמצעות LabVIEW (National Instruments, אוסטין, טקסס). לבסוף, מקדם הדיפוזיה נקבעת על ידי מתאים לשחזור נתונים למודל המתמטי המתאים באמצעות אלגוריתם הפחות ריבועים הולם, לתכנות בקלות באמצעות תוכנות כגון MATLAB (Mathworks, Natick, MA).

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching at JoVE.com

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

במאמר זה נתאר את הליך למדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות רב פוטון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. נתחיל על ידי יישור לייזר לאורך השביל אופטי המדגם קביעת פרמטרים ניסיוניים נאותה, ולאחר מכן להמשיך לייצר והתאמת עקומות בסופו של דבר התאוששות פלואורסצנטי.

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

measuring-diffusion-coefficients-via-two-photon-fluorescence-recovery

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K Views.  University of Rochester. במאמר זה נתאר את הליך למדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות רב פוטון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. נתחיל על ידי יישור לייזר לאורך השביל אופטי המדגם קביעת פרמטרים ניסיוניים נאותה, ולאחר מכן להמשיך לייצר והתאמת עקומות בסופו של דבר התאוששות פלואורסצנטי.

Video: Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...