המחקר נתמך על ידי קרן פרס ח &#39;וולאס קולטר קריירה בתחילת Translational מחקר. הודות טים ​​אנדרוז, להמטולוגיה / Oncology, לעזרה עם אוסף דגימת דם. כמו כן, הודות ד&quot;ר סם ולהאוזן, cytometry Core זרימה, ג&#39;יימס גרהאם בראון Cancer Center, עזרה בניהול תזרים cytometry דגימות.

חלק 1. המכשיר microfluidic ייצור עובש אב סיליקון של המכשיר תמוגה microfluidic נוצר באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי עם הציוד באוניברסיטת לואיוויל cleanroom [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, בסן רפאל, קליפורניה) שימש ליצור מסיכת שקיפות (Fineline הדמיה, קולורדו ספרינגס, CO) כדי ליצור העתקים שלילית של הערוצים. המכשיר תמוגה microfluidic היה מפוברק בין עובש האב סיליקון תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיות רך עם אלסטומר פולי (dimethylsiloxane) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). אלסטומר עם ערוצי משוכפל שוחרר, וגישה ערוץ נוקבו חורים עם מחט 20-מד (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה.). רקיק PDMS היה קשור באופן בלתי הפיך לשקופית זכוכית באמצעות פלזמה חמצן ונבדק לניסויים. חלק 2. פרוטוקול להפעלת המכשיר תמוגה אחרי המכשיר microfluidic כבר מפוברק ונבדק, ניסויים תמוגה כדורית אדומה מוכן להתחיל. פרטים בסעיף הבא את הפרוטוקול עבור המכשיר microfluidic. 2.1 לדוגמה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 4 מ&quot;ל של דגימת דם מהעורק cubital חציון, על עורק הזרוע הקדמי של המטופל עם קרישה כמו הפרין בשני 2 vaccutainers מ&quot;ל העליון ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל הצינור הראשון 2 מ&quot;ל מכיוון שהיא מכילה וחילצה לתאי אנדותל בוגרים (חיוביות שגויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הצינור השני לערבב הפרין עם דם על ידי סיבוב למעלה ולמטה; להציל מיד על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של דם צינור Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. תהליך דגימת דם באופן מיידי (תוך שעה אחת לאוסף). </li></ol> 2.2 המכשיר microfluidic ראש עם PBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מכשיר microfluidic קשור זכוכית. לחץ להתאמה גישה צינורות (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה) בקוטר של מעט יותר את פתחי הכניסה ועל היציאה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מחט מזרק 30-מד (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה) כדי צינורות על כל פתחי הכניסה, מספקת את ממשק מאקרו ומיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ&quot;ל עם 1X PBS ולוודא להיפטר בועות על ידי מצליף את מחט המזרק. חבר את PBS טעון מזרק 1 מ&quot;ל עד 1 כניסת למכשיר microfluidic. לחצו על מזרק המכיל את PBS 1X בעדינות ביד עד לפתרון זורם מתוך כניסת 2, ומיד תפס כניסת 2 עם קליפ קלסר משרדי רגיל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לדחוף את PBS 1X עד נוזל מגיע לנמל היציאה של המכשיר מיקרופלואידיקה. לאחר פתרון זורם מתוך משקע, מהדק את צינור מוצא עם קליפ אחר קלסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לדחוף את המזרק עד 1 מ&quot;ל PBS 1X זורם מתוך כניסת 3, מהדק את יציאת כניסת 3 עם קליפ אחר קלסר משרדי. המכשיר מיקרופלואידיקה כיום ערוכה באופן מלא. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי של המכשיר מראה פתחי הכניסה פתרונות בהתאמה לשקע. 2.3 הכנת משאבות מזרק פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל את משאבות בצע את הפעולות הבאות: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משאבת מזרק גדול הרווארד (Harvard, PhD חלק 22/2000 # 702000): הגדרת תצורת בקוטר 22.5 מ&quot;מ, קצב הזרימה 600 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משאבת מזרק קטן הרווארד (Harvard, פיקו פלוס חלק # 702213): הגדרת תצורת בקוטר 4.61 מ&quot;מ, קצב הזרימה 20 μl / min. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את אחד מזרק 30 מ&quot;ל מים deionized סטרילית. ניתן להשיג זאת על ידי משיכת הפתרון ישירות מן הצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. (לייבל את המזרק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המזרק השני עם 30 מ&quot;ל paraformaldehyde 2X פוספט שנאגרו-מלוחים, (PBS) 2% (PFA) באמצעות ההליך המתואר בשלב 9. (לייבל את המזרק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ&quot;ל עם 1X PBS מן aliquots מאוחסנים 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל, באמצעות ההליך המתואר בשלב 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את 30 מ&quot;ל מים deionized המזרק כניסת 2 ו 30 מ&quot;ל 2X מזרק PBS על כניסת 3 (לוודא שאתה לא בועות לא מלכודת בצינור או ההתקן מיקרופלואידיקה). הסר את מהדק מ פתחי הכניסה 2 ו -3 ואת צינורות מוצא. חבר את 1X PBS 1 מ&quot;ל מזרק לתוך מפרצון 1. הימנע מציגה בועות ידי מילוי מחט מזרק עם נוזל, לחבר את המזרק, והוא מצליף את מחט המזרק כדי להיפטר מבועות. </li></ol> 2.4 כדורית אדומה תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כל המזרקים על משאבות נאות הרווארד כמפורט להלן: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט שני מזרקים 30 מ&quot;ל (אחד המכיל סטרילי, דה מיוננים מים והשני עם 2X PBS, PFA 2%) יחד על המשאבה הרווארד מזרק גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מזרק 1 מ&quot;ל (המכיל 1X PBS) על המשאבה הרווארד מזרק קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את צינור מוצא ב אספן פסולת (50 מ&quot;ל צינור חרוטי אשר מתויג waste). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד מזרק גדול (עם מזרקים 30 מ&quot;ל) ולתת לו לרוץ במשך דקה אחת. (ודא שאין בועות ואין דליפה במכשיר או בצינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד מזרק קטן ולתת לו לרוץ במשך דקה נוספת. (ודא שאין בועות ואין דליפה במכשיר או בצינור). עצור את המשאבות. המכשיר מיקרופלואידיקה עכשיו הוא מוכן לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המזרק 1 מ&quot;ל המכיל 1X PBS מהמשאבה הרווארד מזרק קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קבלת דגימת דם, למלא את המזרק עם 1 מ&quot;ל של 0.05 מ&quot;ל סטרילי 1X PBS ללא השמנה כל הבועות. בשלב הבא, למלא את המזרק עם 0.5 מ&quot;ל של דם המתקבל הצינור Eppendorf. (מזרק 1 מ&quot;ל כעת להכיל נפח הסופי של 0.55 מ&quot;ל של דם ושל חיץ 1X PBS). הערה: שמור את המזרק אנכי בעת מילוי כדי למנוע ערבוב של 0.05 מ&quot;ל PBS בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מזרק המכיל את הדם אל מפרצון 1 ו - הר את המזרק בזהירות (שלא לדחוף את הדם דרך צינורות לתוך המכשיר) על המשאבה הרווארד מזרק קטן (את המזרק הוא רכוב אנכי לתוך המשאבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור מוצא מהצינור פסולת לשים צינור נקי צנטריפוגה 50 מ&quot;ל במקומו והניח אותה על דלי של קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד גדול מזרק הראשון ולתת לו לרוץ במשך דקה 1. התחל באיסוף מדגם משקע לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד מזרק קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימת דם מזרק 1 מ&quot;ל נסעה לחלוטין דרך המכשיר, לעצור שני משאבות. זה אמור לקחת בערך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם שנאספו במשך 5 דקות ב 350 XG בטמפרטורת החדר עם מהבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ידי הצבת קצה פיפטה בצד הנגדי של גלולה לבנה. הסר כמו supernatant כמה פסולת, אפשרי תא אדום במיוחד, מבלי להפריע גלולה לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המדגם ב 1 מ&quot;ל של חיץ זרימה (1X PBS, 1% BSA [שור אלבומין בסרום], 2% PFA) על ידי pipetting למעלה ולמטה. העברת מדגם צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge המדגם נאספו במשך 5 דקות על XG 4 בטמפרטורת החדר. השתמש דיוק כמו קודם להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המדגם מ&quot;ל 1 של חיץ תזרים ידי vortexing. </li></ol> 2.5 הכנה לניתוח זרימת cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח מדגם באמצעות cytometry זרימה, להוסיף 100 μl של מדגם צינור cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי μl 100 המדגם להוסיף נוגדן שצוין (להבטיח ריכוז נכונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המדגם כדי לדגור במשך 30 דקות ב 40 ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם חיץ תזרים לפני cytometry הזרימה. צעד לשטוף כוללת הוספת 250 μl של חיץ זרימה, vortexing, centrifuging במשך 5 דקות ב 350 XG, והסרת supernatant עם תור של צינור נוזל cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 250 μl של חיץ לזרום. לדוגמה מוכן לניתוח על ידי cytometry הזרימה. </li></ol> נציג תוצאות דם שלם הופעל דרך המכשיר תמוגה microfluidic שלאחר עיבוד פרוטוקול, ridding של אריתרוציטים ומעשיר במחזור התאים בעלי הגרעין (CNCs). תוצאות אידיאלי תניב תזרים נקי cytometry פיזור העלילה עם אוכלוסיות נפרדות CNC. הוצג להלן דמויות 2 ו -3 הם העלילה פיזור השוואות של דגימת דם שלם בלי תמוגה כדורית אדומה עם תמוגה כדורית אדומה ידי פרוטוקול microfluidic עם צירים כמו פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) אור. ניתן לראות כי פרוטוקול העשרה microfluidic הוא הכרחי כדי להשיג תזרים נקי cytometry העלילה פיזור. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Cytometry זרימה פיזור העלילה של כל דגימת דם ללא תמוגה כדורית אדומה עם FSC וגרזנים SSC. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Cytometry זרימת העלילה פיזור של מחזורי התאים בעלי הגרעין עם תמוגה כדורית אדומה microfluidic שכותרתו ידי אוכלוסיות עם FSC וגרזנים SSC. אזור 1 (אדום) מייצג לימפוציטים, אזור 2 (ירוק) מייצג מונוציטים, אזור 3 (כחול) מייצג גרנולוציטים, ואזור 4 (סגול) עדיין לא מאופיין. סילוק פסולת תא אדום על ידי פיפטה בפרוטוקול חשוב גם בעת הצורך. להלן באיור 4 הוא העלילה פיזור מראה עודף של פסולת תא אדום. למרות שלא ערפול העלילה פיזור כמו באיור 2, צריך להסביר את האירועים הוסיף בשל פסולת כדורית אדומה במהלך ניתוח הנתונים. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים פסולת תא אדום, כפי שניתן לראות באשכולאירועים באזור 5 (ציאן). תאים מכתים עבור סמנים פנוטיפ מסוים נוגדנים יהיה גם להפיק תוצאות אופייני. בנתונים הבאים פנוטיפ נוגדן כתמים עבור 3 אוכלוסיות לויקוציטים שונים: לימפוציטים, מונוציטים, ו גרנולוציטים. איור 5 מתאר אוכלוסיות לימפוציטים זממו עם גרזנים CD3 CD4 ו. גרנולוציטים ומונוציטים ו מוצגים איורים 6-7 עם צירים כמו FSC לעומת CD14 ו CD66b, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים לימפוציטים עם CD3 CD4 וגרזנים. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים מונוציטים עם FSC ו CD14 צירים. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים גרנולוציטים עם FSC וגרזנים CD66b.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

תמוגה אוטומטיות microfluidic פרוטוקול בדם דווחה. בתוך הפרוטוקול הם צעדים קריטיים ראוי לציין. בסעיף P.2.1, חשוב להשליך את הבקבוקון הדם הראשונה שנאספו במדגם מכיל וחילצה לתאי אנדותל בוגרים מתנהג כמו חיוביות שגויות. ודאו גם להפעיל את דגימת דם בתוך שעה של אוסף. תחול המכשיר microfluidic ...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

בדו&quot;ח זה פרוטוקול עבור מכשיר אוטומטי תמוגה microfluidic דם מפורט. במחזור התאים בעלי הגרעין (CNCs), כולל לויקוציטים ותאי האנדותל, לספק פלטפורמה אידיאלית עבור מצב עדכנית על מצב המערכת החיסונית של אדם. פרוטוקול microfluidic מאפשרת העשרה של CNCs ללא הפסד תא סלקטיבית הכנת המדגם השתנות עקב המשתמש בתיווך צעדים. בקצרה, הפרוטוקול כולל ייצור המכשיר, אוסף מדגם, הגדרת המכשיר, והפעלה הדם דרך תא microfluidic. בתוך המכשיר הדם כולו מעורבב במהירות של כ 10 שניות בתוך 50 מיקרון ערוץ x 150 microfluidic מיקרון עם מים deionized. בזמן הזה הם אריתרוציטים תוחלת lysed בשל תנאי hypotonic. מבנים אדרה בתחתית הערוץ להבטיח ערבוב יסודי חשיפה של תאים לסביבה קבוע. התאים הנותרים הם חזרו לתנאים איזוטוני ביציאה של המכשיר, שימוש קבוע paraformaldehyde 2%, centrifuged להפריד פסולת כדורית אדומה מן CNCs, ותלויה חיץ זרימה עבור מכתים וניתוח על ידי cytometry הזרימה. תוצאות להראות נקי cytometry זרימה פיזור חלקות עם אוכלוסיות CNC נשמר. המשמעות של המכשיר הזה מגיע פרוטוקול במחקר והבנה של בהיווצרות המחלה על ידי ניתוח של אוכלוסיות CNC. לפיכך, אוטומציה, יעילות, ופשטות של פרוטוקול microfluidic הם הפגינו.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells at JoVE.com

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

מכשיר אוטומטי microfluidic פותחה עבור במחזור העשרה תא גרעיני מן הדם ההיקפיים באמצעות תמוגה כדורית אדומה המבטיח בידוד המדגם באיכות גבוהה ללא אובדן התא.

תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Views.  University of Louisville. מכשיר אוטומטי microfluidic פותחה עבור במחזור העשרה תא גרעיני מן הדם ההיקפיים באמצעות תמוגה כדורית אדומה המבטיח בידוד המדגם באיכות גבוהה ללא אובדן התא.

Video: Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...