העבודה המתוארת נתמך על ידי מרכז קורנל על Microenvironment &amp; גרורה דרך מספר פרס U54CA143876 מן המוסד הלאומי לסרטן. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים. עבודה זו מומנה בנוסף ידי הקרן הלאומית למדע מלגת מחקר לתואר שני (ADH) בחלקו.

פרוטוקול הבאה היא לייצור מכשיר microtube אחת. 1. הכנת פתרון Nanotube Halloysite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate (10-13 וואט (RMS)) 250 halloysite μL Nanotube פתרון (6.6% WT במים) 30 שניות. פתרון מגניב עם מים קרים sonication חוזרת פעם אחת. מצננים שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר פתרון sonicated לתוך מזרק, חבר 0.45 מזרק מסנן מיקרומטר, והפתרון המסנן לתוך צינור microfuge נקי. הפתרון וורטקס מדי פעם כדי לשמור על אחידות. </li></ol> 2. ציפוי של משטח Microtube פנימית עם צינורות halloysite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל 50 ס&quot;מ בחלק הארוך של microtubing מיקרו Renathane (300 מיקרומטר קוטר פנימי, 35.3 נפח פנימי μL). חותכים קצה אחד של microtube ב באלכסון ולהכניס לתוך חתיכת IDEX מתאם קטן. הכנס את המחט של המזרק 29G 3/10 סמ&quot;ק אל הקצה השני של microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את microtube, מקם את הקצה הפתוח של microtube (סוףעם מתאם) אתנול 70% ולצייר ~ 50 אתנול μL לתוך המזרק למלא microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את אתנול מתוך microtube על ידי ציור נפח נדיב של מים מזוקקים לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את המזרק מ microtube, לרוקן את המזרק, ואז לצרף את microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה של 0.02% w / v פולי-L ליזין במים. צייר 50 μL אל microtube ולאפשר לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 100 Nanotube μL פתרון הסתנן אל microtube ולאפשר כדי לדגור על 3 דק &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 100 מים μL דרך microtube לשטוף את הפתרון Nanotube. אפשר microtube מצופה לשבת, מלא מים, למשך הלילה בבית RT. </li></ol> 3. הכנת Microtubes על בידוד תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​חלבון G ב פוספט 1X של Dulbecco בופר סליין (PBS, pH 7.0-7.2). צייר 50 PBS μL דרך microtube ואז לצייר 50 μL שלהפתרון חלבון G ולאפשר כדי לדגור על 1.5 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה המכילה 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​E-selectin-IgG ו - 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​נוגדנים (אנטי EpCAM עבור דגימות סרטן רוב, אנטי PSMA עבור דגימות סרטן הערמונית) ב PBS. צייר 50 μL של selectin-E פתרון נוגדנים לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על משאבי אנוש 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידבקות הסלולר ספציפי חסום עם חלבון חלב 5%. הכן את הפתרון של 5% (w / v) חלבון חלב PBS. צייר 50 הפתרון μL חלבון החלב לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על שעות 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 50 PBS μL לתוך הצינור ולהשאיר על RT עד דם או באפי דגימות המעיל מוכנים לעיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני השימוש microtube לבידוד, צייר 50 PBS μL כי כבר רווי Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) כדי להפעיל את מולקולות selectin. </li></ol> 4. הכנת דגימות לבידוד בתא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר או להשיג 10 מ&quot;ל דם מחולה לתוך heparinizedצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 10 מ&quot;ל Ficoll-Paque פתרון לימפוציטים הבידוד לתוך צינור 50 צנטריפוגות מ&quot;ל. בעדינות 10 מ&quot;ל שכבת הדם כולו על גבי Ficoll כדי לא לערבב את הדם Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2000x גרם במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם האטה מינימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את שכבת מעיל באפי ומכניסים צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף באפי מעיל עם PBS (צנטריפוגות ב 230x גרם דקות 10, לבטל את supernatant). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאים עם חיץ 1 תמוגה RBC מ&quot;ל ו דגירה של 10 דקות על RT כדי lyse אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS, מערבבים בעדינות, צנטריפוגות ב 230x גרם ל 10 דקות. מחק supernatant בעדינות resuspend גלולה ב 3-4 מ&quot;ל PBS +. </li></ol> 5. תא בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קצה אחד של microtube פונקציונליות כדי מזרק 5 מ&quot;ל באמצעות מתאמי IDEX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הקצה הפתוח של microtube פונקציונליות לתוך התא suspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך ההשעיה התא דרך microtube ב 1-4 מ&quot;ל / h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הקצה הפתוח של microtube כדי צינור המכיל PBS + ולצייר 300 μL + PBS לתוך המזרק על 0.016 מ&quot;ל / דקה להסיר מאוגד ותאי המרופט מ microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה הפתוח של microtube לתוך צינור נקי. נתק את המזרק מ microtube ולצרף מזרק עם Accutase. בעדינות perfuse Accutase מספיק לתוך microtube למלא (~ 50 μL) ולאפשר כדי לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק עם 1 מ&quot;ל של התקשורת הצמיחה (79% RPMI, FBS 20%, 1% סטרפטומיצין פניצילין) ו perfuse אל microtube, איסוף שפכים לתוך התרבות רקמת יחס טוב צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתנאים humidified. </li></ol> 6. נציג תוצאות מטרת טכניקה זו היא לבודד את התאים הסרטניים קיימא מדם של חולי סרטן. קיימים מספר שיטות לזיהוי תאים סרטניים בתרבית, אימות הכרחי להצלחת המכשיר. בחרנו כתם התאים בתרבית עם נוגדנים נגד moieties אפיתל כמו EpCAM (הידבקות אפיתל מולקולה תאית) או PSMA (אנטיגן ספציפי לערמונית קרום), בנוסף DAPI לזהות גרעיני תאים שלמים (איור 2 ו 3). מספר תאים סרטניים שנתפסו באמצעות טכניקה זו היא בהכרח פונקציה של מספר CTCs במדגם ההתחלה וכי השונות המטופל יכול להיות גבוה. בעיבוד דגימות שנלקחו מהחולים שאובחנו עם סרטן בשלב IV, אנחנו באופן שגרתי ללכוד בין 100 ל 500 תאים סרטניים בכל צינור של דם, על purities&gt; 50%. מיד לאחר הבידוד, מספר גדול יותר של כדוריות דם לבנות מזהמים יכולים להיות נוכחים. עם זאת המספרים הללו ייגמרו הדגירה הבאה במדיום התרבות של עד 5 ימים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; באיור 1. סכמטי של microtube פונקציונליות עבור בידוד CTC, מראה selectin בתיווך מתגלגל אחריו הידבקות נוגדנים בתיווך סטטי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> איור 2. נתונים מייצגים של בידוד CTC של דגימות דם נמשך מחולה סרטן השד חולת סרטן ריאות. מספר תאים קיימא המזוהים באופן חיובי כמו CTC מבוסס על מכתים EpCAM מיוצג על ידי מוטות מוצקים מתייחסים לתאם שמאל אחוז תאים שזוהו כמו CTC בהשוואה למספר הכולל של תאים שנכבשו מיוצג על ידי הברים פתוחים נמדד על לתאם הנכון. התוצאות לאחר חמישה ימים בתרבות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> באיור 3. נציג micrographs מתורמים שונים (A ו-B) של CTC בתרבות 5 יום ממועד isolatiעל פי מדגם החולה בסרטן הדם. התאים היו מוכתמות fluorescently עם AlexaFluor 488 (ירוק) ו 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור EpCAM לדמיין את הגרעין (כחול).

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

Mrk הוא היועץ המדעי של CellTraffix, Inc (רוצ&#39;סטר, ניו יורק).

זה שקורה לעתים קרובות כי השלבים המוקדמים של גילוי ותרופות לסרטן חדשים לנצל תאים סרטניים קווים, הנושאים דמיון בספק לתאי סרטן ראשוני עדיין להישאר להשתמש בשל קלות השימוש שלהם במעבדה. מחקר ופיתוח של טיפולים בסרטן חדשים יהיה לזרז אם העיקריים תאים סרטניים אנושיים נוצלו בתחילת המחקר רומן. CTC הם סוג ביותר ונגיש של תאים סרטניים, עקב נוכחותם בדם קלות בתיקו דם רגילה. בנוסף, בתאי הגידול במחזור מייצגים צעד הכרחי בתהליך של גרורות 5,6, ולכן הרלוונטיות שלהם המחלה השירות למיקוד תרופות חדשות הוא ברור. הבידוד של CTC מהדם במבחנה מסובך ידי ריכוזים נמוכים שלהם: בסדר גודל של 1 למיליון כדוריות דם לבנות או אחד למיליארד אריתרוציטים 7. רוב השיטות הקיימות לאיתור CTC בדם, כולל תא ה-FDA רק טכניקה<html> חיפוש (Veridex), נזק או להרוס תאים בתהליך איתור, לא ניתן להשתמש מעבר ספירה. השיטה המתוארת לעיל לא להתפשר כדאיות התא ובכך פותח את הדלת עבור מחקרים קליניים בעתיד על סרטן. כמו התאוששות של תאים שלמים היא המטרה של טכניקה זו, זוהי חובתו של תאים להיות מטופלים בזהירות, במיוחד במהלך השלבים הפרדה דם. ישנם מספר פרמטרים מתכונן במערכת זו, כי אפשר לשנות על מנת להשיג תשואה משופרת בהתאם מאפיינים קריטיים כגון סוג סרטן. בשלבים המתוארים לעיל, בחרנו להשתמש EpCAM כמו CTC נוגדנים ספציפיים עבור כל סוגי הסרטן, למעט בעת עיבוד דגימות סרטן הערמונית, שבה אנטי PSMA היה בשימוש. החלפות נוספים של סרטן ספציפיים נוגדנים בהחלט יכול לשמש כדי לשפר את הביצועים עבור חולים בודדים. יתר על כן, ריכוזים selectin ו הנוגדן ניתן לשנות על מנת לשפר ללכוד 8. &quot;&gt; התכונה המהותית של המכשיר הוא שילוב של E-selectin מולקולות על פני השטח. E-selectin בא לידי ביטוי בדרך כלל על פני השטח של תאים luminal אנדותל ותפקוד לגייס leukocytes זז מהר לאתרים של דלקת. Leukocytes זורמים לאגד זמני ל מולקולות selectin, וכתוצאה מכך התנהגות, איטי יותר מתגלגל המאפשר מחייב איטי יותר וחזק יותר של תא האנדותל את ידי integrins. ראיה נסיונית משכנע קיים שעושה את המקרה כי CTC יכול extravasate ידי מנגנון דומה 9,10. הכללת selectin גם מאפשר למכשיר להיות מופעל ברמות ספיקה גדולות יותר, שיעורי שאחרת למנוע מתאי מלהתחבר נוגדנים 11. כך המכשיר שלנו פיזיולוגית מחקה ורדיד biomimetically כדי ללכוד זרימת CTC ללא גרימת פציעה הסלולר. ביצועי המכשיר משופרת ניתן לייחס תוספת של ציפוי Nanotube halloysite אל פני השטח luminalשל המכשיר. מחקרים קודמים הראו כי ישנם שלושה מרכיבים עיקריים של ציפוי Nanotube המאפשר פונקציונליות משופרת. ראשית, ציפוי Nanotube מספק שטח פנים גדל, המאפשר בתצהיר חלבון גדולה יותר על פני 4. שנית, בביצוע במיקרוסקופ כוח אטומי על ציפוי Nanotube שקבענו צינורות בודדים בולטים מעל פני השטח אל תוך הזרם. זה מאפשר מולקולות selectin שיוצג ככל 1 מיקרון מעל פני השטח, כך ניתן ללכוד תאים וגייס אל פני השטח בתחילת המסלול שלהם דרך צינור 4. לבסוף, ציפוי Nanotube halloysite הוא מסוגל למנוע הידבקות ליקוציט ומתפשטת על פני השטח, המאפשר מספר מופחת של כדוריות דם לבנות שנתפסו יחד עם CTC, ולכן יותר purities הבאים CTC 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 300 מזהה אום צינורות </td><td> Braintree Scientific </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> צינורות גדול יותר עבור חיבור המזרק </td><td> IDEX לבריאות ומדע </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> מזרק 5 מ&quot;ל של משאבת </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> קטן בצינור גדול מחבר </td><td> IDEX לבריאות ומדע </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> מחבר צינורות גדול מזרק </td><td> IDEX לבריאות ומדע </td><td> F-120 ו-P-659 </td></tr><tr><td> מזרק על microtube (מזרק אינסולין 3/10cc U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque פלוס </td><td> GE Healthcare ביו למדעי AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC תמוגה חוצץ (Buffer EL, 1000mL) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> גרם חלבון, 5 מ&quot;ג </td><td> CalBiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> נוגדן אנושי EpCAM/TROP-1 </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA נוגדן (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96 צלחות גם Microtest (96) </td><td> BD פלקון </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> סופג חוסם כיתה ללא שומן חלב יבש, 300 גרם </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloysite צינורות </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> סידן קרבונט, 5G </td><td> אולדריץ כימיה </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc כימרה, 100 מיקרוגרם </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI בינוני 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> פולי-L ליזין 0.1% w / v במים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סוניק Dismembrator </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> דגם 100 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביוכימיקלים </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> סיגמא החיים Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

בתאי הגידול במחזור (CTC) הם תאים מן הגידול המפיצים העיקרי בכל מערכת הדם וזה יכול בסופו של דבר יוצרים גידולים משניים באתרים מרוחקים. CTC ספירת ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה בהתבסס על הקשר בין ריכוז CTC בדם חומרת המחלה 1. ככלי טיפולי, CTC יכול להיות למד במעבדה לפתח טיפולים מותאמים אישית. לשם כך, בידוד CTC גרם שום נזק לתאים, וזיהום על ידי סוגי תאים אחרים, במיוחד leukocytes, יש להימנע ככל האפשר 2. רבים טכניקות הנוכחי, לרבות מכשיר ה-FDA הבלעדי של ספירה CTC, להרוס CTC כחלק מתהליך הבידוד (למידע נוסף ראה Ref. 2). המכשיר microfluidic ללכוד CTC קיימא מתואר, המורכב משטח פונקציונליות עם גליקופרוטאין E-selectin בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל 3. כדי לשפר את ביצועי המכשירmance ציפוי nanoparticle יושמה בהיקף של צינוריות halloysite, nanoparticle aluminosilicate שנקטפו מן החומר 4. את ה-selectin מולקולות לספק אמצעי ללכוד CTC זז מהר, כי הם נשאבים באמצעות המכשיר, השאלת יתרון על פני מכשירים microfluidic חלופיות שבו תהליך העיבוד של יותר נחוצים כדי לספק תאים היעד עם מספיק זמן כדי אינטראקציה עם פני השטח. את הנוגדנים ליעדים אפיתל לספק CTC-הספציפיות למכשיר, כמו גם לספק פרמטר מתכוונן בקלות לכוון בידוד. לבסוף, ציפוי Nanotube halloysite מאפשר בידוד משופר באופן משמעותי לעומת טכניקות אחרות של עוזר ללכוד תאים זז מהר, מתן שטח מוגברת של חלבון ספיחה, ולהדוף leukocytes מזהמים 3,4. מכשיר זה מיוצר על ידי טכניקה פשוטה באמצעות ה-off-המדף חומרים, שימש בהצלחה ללכוד תאים סרטניים מהדם של גרורתיחולי סרטן. התאים שנתפסו יישמרו לתקופה של עד 15 ימים בתרבות בעקבות הבידוד, ודגימות אלו בדרך כלל מורכב&gt; תאים קיימא 50% סרטן ראשוני של כל מטופל. מכשיר זה נעשה שימוש כדי ללכוד CTC קיימא מהדם הן כל בדילול מלא דגימות באפי המעיל. בסופו של דבר, אנו מציגים טכניקה עם פונקציונליות בסביבה קלינית לפתח טיפולים בסרטן אישית.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples at JoVE.com

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K Views.  Cornell University. בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

Video: Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

חומצה היאלורונית מבוסס Hydrogels לתרבות תלת-ממדי של החולה-Derived גליובלסטומה תאים

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

ייצור פנטום פוליוויניל אלכוהול ספציפי למטופל עם אולטרסאונד וניגוד רנטגן לתכנון ניתוח גידול במוח

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.