עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) כדי להעניק AI063433 לורנס ג רחמה, מכון המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מרכז גרנט (P50GM021700) כדי רונלד ג טומפקינס (א &#39;אריה ציקה, מנהל הליבה NMR), ובית החולים של שריינרים לילדים מענק מחקר (# 8893) א &#39;אריה ציקה. אנו מודים Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. סיוע בשלבים הראשונים של פיתוח זה פרוטוקול Ovidiu ג Andronesi Ph.D. לקבלת סיוע עם רצף הדופק TOBSY.

חלק 1: תסיסנית הכנה מדידות HRMAS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תקן flylab נהלים 1, לאסוף החדש eclosing זבובים במשך 3 ימים ולהעביר אותם לטוס צלוחיות המכילות מזון לעוף טרי. דגירה הזבובים שנאספו במשך 5 ימים, כך הזבובים יהיה 5-8 ימים רק לפני הניסוי. רק מין אחד (בדרך כלל גברים) משמש עבור ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בריאים, סוג בר שלם זבובים להשוות עם טיפול בטראומה למשל או שינו גנטית זבובים 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום זבובים בודד לתוך צינורות 2ml המכילה פיסה (~ 0.2ml) של מזון לטוס 24 שעות לפני הניסוי. צינורות אלה לשאת חור כוס הצינור עשוי באמצעות מחט להבה מחומם אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינורות מיד לפני ואחרי הכניסה את הזבוב באמצעות איזון דיוק גבוהה להגדיר משקל של כל זבוב ידי הפחתת הערך הראשון של הלה. זבוב זכר יחיד שוקל בדרך כלל 0.7-1 מ&quot;ג. </li></ol> חלק 2: הכנת HRMAS רוטור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינור יחיד על קרח פחות מדקה להרדים בתוך לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את זבוב על שכבה של נייר אלומיניום דגש על קרח לדחוף בעדינות לטוס לחלל חלול semispherical של להכניס את הרוטור NMR בעזרת מברשת רכה כדי להבטיח חיבור לעוף שלם, תוך הימנעות מפגיעה לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להכניס תחמוצת זירקוניום (ZrO 2) צינור הרוטור (4 מ&quot;מ קוטר, 50 μl) כדי לאתר את הזבובים בין להכניס את הרוטור התחתון של הרוטור (ראה figure1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הכנס עם בורג ולכסות אותו עם parafilm (ראה figure1) כדי למנוע את המגע בין זבוב לבין פתרון סטנדרטי כפית (כפית: trimethylsilyl-propionic-2-D4 ,2,3,3 חומצה, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 מ&quot;מ deuterated מים-D 2 O, כי הפונקציה כהתייחסות למשמרת הן תהודה כימיים וכימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של פתרון כפית רגילה על גבי להכניס את הרוטור. (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure והדק את כל להגדיר את הרוטורים עם כובע העליון (ראה תרשים 1). </li></ol> חלק 3: HRMAS Data Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את הרוטור לתוך החללית HRMAS ומקם אותה בזווית הקסם 54.7 ° (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הטמפרטורה 4 מעלות צלזיוס על ידי יחידת BTO-2000 בשילוב עם יחידת MAS פנאומטי. זבובים נשמרים בעוד 4 מעלות צלזיוס בתוך הספקטרומטר לשמור על הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את H 1 HRMAS שיעור ספינינג גברת ב 2 MAS קילוהרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את התדר MAS סיבוב ב 2.0 ± 0.001 kHz על ידי בקר MAS מהירות (תדירות סיבוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכנת מגנט: המנגינה ולהתאים את סליל עבור ביצועים אופטימליים פחית מגנט באיכות אופטימלית של הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את אחת ספקטרה ממדי 1 H באמצעות הרוטור מסונכרן קאר, פרסל, Meiboom-גיל (CPMG) ספין הד הדופק רצף 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-רכישה], אשר פועל כמסנן T 2 ל להסיר את הרחבת הספקטרום 1 H NMR יחיד לטוס ספקטרה כדי רכשה חד ממדי נתונים על כל הדגימות. סנכרן את העיכוב בין דופק (τ = 500μs) לתדר MAS את הסיבוב (2 קילוהרץ). הגדר את מספר הארעיים ב 256 עם 32,768 (32K) נקודות נתונים. זמן רכישת 9 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת דו ממדי (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR יחיד לטוס ספקטרום על כל הדגימות באמצעות רצף TOBSY עם פולסים adiabatic 3. הפרמטרים רכישת הם: 2k נקודות נתונים מימד ישיר (11 עמודים לדקה רוחב הספקטרום), 1 של מים מראש הרוויה במהלך העיכוב הרפיה, 8 סריקות לכל תוספת, במרווחים של 128, זמן החזרה סך של 2, 45 ms זמן ערבוב, רכישה בסך הכל זמן של 29 דקות. </li></ol> חלק 4: עיבוד נתונים / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות MRspectra MestReC באמצעות תוכנה (Mestrelab המחקר, www.mestrec.com) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קו הרחבה פונקציה apodization של הרץ 0.5 וחלים על כל 1 FIDs HRMAS H לפני השינוי פורייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפניה ספקטרה MR ביחס כפית עמודים לדקה δ = 0.0 (תקן חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב ספקטרום ידני ולהחיל אומד הבסיס וויטאקר תפחית את הרכיבים רחב של הבסיס לפני החישובים אזור השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אומדן שטחים שיא באמצעות תוכנת MestReC. סולם גבהים שיא ביחס כפית עבור כל קשת רכשה (כפית גובה שיא = 1). השתמש t-בדיקות (שני זנב, p &lt;0.05), להשוות בתוך הקבוצה בין קבוצות יחסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2D פרמטרים TOBSY התהליך הם: QSINE = 2 פונקציה חלון בשני המימדים, FT עם נקודות 2k בממד ישיר אפס מילוי כדי 1k בממד השני, תיקון פאזה בשני הממדים תיקון הבסיס בממד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר את ספקטרום 2D באמצעות ספרקי התוכנית (TD גודארד ו DG Kneller, ספרקי 3, USCF, <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/</a>בית / ספרקי /) </li></ol> חלק 5: ספקטרה נציגת חיים תסיסנית melanogaster זבובים הנהלים שתוארו לעיל היתר לאסוף ספקטרה לשחזור מתוך לחיות זבובי תסיסנית melanogaster. איורים 2 ו -3 מראים נציג MR ספקטרה שנרכש wild-type (wt) אורגון-R זבובים. תרשים 2 מציג 1D 1 H ספקטרה HRMAS CPMG. השומנים המרכיבים העיקריים [ג H 3 (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm)], גליצרול (1,3 C-H ו - 4.10 ppm 4.30 עמודים לדקה; 2-CH 2 5.24 ppm), ומטבוליטים קטנה: β-אלאנין (β-עלא , 2.57 ppm), אצטט (AC, 1.97 ppm), phosphocholine (PC, 3.22 לדקה) ו phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) התגלו והוצב על פי הדיווחים לפני 4, 5. איתותי עמודים לדקה 2.02 חולקו פרוטונים מתילן של מחצית H2-CH = CH-C של מונו חומצות שומן בלתי רוויות (כלומר palmitoleic). חומצות בלתי רוויות זוהו על ידי אות עמודים לדקה 5.33 המיוצר על ידי פרוטונים של מחצית-CH-CH =. מטבוליטים קטנים שלא ניתן היה מוקצה, או שלא נראו באמצעות ספקטרום 1D התגלו באמצעות 2D 1 H-1 H TOBSY HRMAS (ראה איור 3). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ניסיוני להגדיר של in vivo HRMAS 1H גברת לחקירת לחיות תסיסנית על חומצה 14.1 ,2,3,3-D4 ט חיצוני סטנדרטי trimethylsilyl-propionic-2 במים deuterated (כפית / D 2 O). בכיכר: מיקום הרוטור בזווית קסם HRMAS בדיקה. <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Vivo ב 1D HRMAS ספקטרה 1 CPMG H של זבוב חי תסיסנית wt melanogaster. שומנים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), אצטט (AC), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), β-אלאנין (β-עלא), phosphocholine (PC) ו phophoetanolamine (PE), גליצרול (1,3 C-H 4.10, 4.30 עמודים לדקה; 2-C H 2 5.22 ppm) , C = C H H (5.33 ppm). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Vivo 2D 1H-1H TOBSY ספקטרום HRMAS של זבוב תסיסנית לחיות wt melanogaster ב 14.1 מטבוליטים ט קטנים ורכיבים השומנים זוהו. מטבוליטים: אלאנין (עלא), β-אלאנין (β-עלא), ארגינין (Arg), גלוטמין (Gln), גלוטמט (Glu), phosphocholine מחשב (PC), phophoetanolamine (PE), טאורין (טאו), α-גלוקוז (α-Glc) ו גליצרול. ליפידים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58 ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm).

<ol>
	<li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li><li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time.">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li><li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy.">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li><li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis.">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li><li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures.">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li><li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla.">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li><li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses.">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית החולים הכללי מסצ&#39;וסטס ועדת המחקר מוסדיים בעלי חיים הדירקטוריון סקירה.

למעט הדוח האחרון של היתכנות של MRI in vivo בפרי זבובים 6, in vivo גברת לימודי תסיסנית טרם דיווחו. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את יישום רומן בגישה vivo HRMAS H-1 גברת לאיתור מולקולות חשובות מבחינה ביולוגית. במפורש, זיהינו שומנים מטבוליטים קטנים לחיות ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Deuterium oxide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>7789-20-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>24493-21-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agar, sucrose, yeast, cornmeal</td>
<td>Food</td>
<td>Genesee Scientific Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.flystuff.com/">http://www.flystuff.com/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon RS or Canton-S flies</td>
<td>Adult fly lines</td>
<td>Bloomington Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://flystocks.bio.indiana.edu/">http://flystocks.bio.indiana.edu/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Paintbrush</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(size 0)</td>
</tr>
<tr>
<td>2ml tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>K749521-1590</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly incubators</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe </td>
<td>Equipment</td>
<td>Bruker Bio-Spin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit</td>
<td>Equipment</td>
<td>Bruker Bio-Spin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul)</td>
<td>Equipment</td>
<td>Bruker Bio-Spin</td>
<td>B3829 (Bruker store)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MestReC (Mestrelab Research) </td>
<td>Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1D NMR spectra analysis <a href="http://mestrelab.com/">http://mestrelab.com/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>SPARKY 3, USCF</td>
<td>Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2D NMR spectra
analysis
 <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

magnetic resonance spectroscopy of live drosophila melanogaster using magic angle spinning

ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג (HRMAS) פרוטון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית (<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS) היא טכניקה רומן הרסני המשפרת ספקטרלי, רוחב קו ומאפשר ברזולוציה גבוהה ספקטרה להיות המתקבל תמציות, תאים שלמים, תרביות תאים, ורקמות יותר שלם וחשוב לחקור את היחסים בין מטבוליטים ועל תהליכים תאיים.<em&gt; ב-vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS מחקרים טרם דווח על זבוב הפירות לחיות<em&gt; תסיסנית melanogaster.</em&gt;<em&gt; תסיסנית,</em&gt; כאורגניזם גנטית פשוטה, מאפשר תפקודים ביולוגיים רבים ומגוונים מסלולי איתות שמור באבולוציה להיבחן ברמת האורגניזם השלם, וזה מודל שימושי לחקר הגנטיקה ופיזיולוגיה. לשם כך, פיתחנו ויישמנו<em&gt; In vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS שיטה לחקור לחיות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב 14.1 ט &#39;הנה, אנחנו המתאר HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS פרוטוקול לאפיון מולקולרי של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עם ספקטרומטר MR קונבנציונאלי מצויד בדיקה HRMAS. טכניקה זו היא רומן,<em&gt; In vivo,</em&gt; שאינו הרסני<em&gt; תסיסנית</em&gt; גישת מדידה המטבוליט, המאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים למחלה ולכן עשויים לתרום לפיתוח טיפולית חדשנית.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning at JoVE.com

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

טכניקה זו מאפשרת את השימוש זווית ברזולוציה גבוהה קסם ספינינג פרוטון MR ספקטרוסקופיה (HRMAS 1H-MRS) לאפיון מולקולרי של חיים<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; עם קונבנציונלית 14.1 טסלה ספקטרומטר מצויד בדיקה HRMAS.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

magnetic-resonance-spectroscopy-live-drosophila-melanogaster-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

12.4K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. טכניקה זו מאפשרת את השימוש זווית ברזולוציה גבוהה קסם ספינינג פרוטון MR ספקטרוסקופיה (HRMAS 1H-MRS) לאפיון מולקולרי של חיים תסיסנית melanogaster עם קונבנציונלית 14.1 טסלה ספקטרומטר מצויד בדיקה HRMAS.

Video: Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of neurological and psychiatric disorders such as stroke and depression. Yet, the mechanisms underlying its ability to modulate brain excitability to improve clinical symptoms remains poorly understood 33. To help improve this understanding, proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) can be used as it allows the in vivo quantification of brain metabolites such as &#947;-aminobutyric acid (GABA) and glutamate in a region-specific manner 41. In fact, a recent study demonstrated that 1H-MRS is indeed a powerful means to better understand the effects of tDCS on neurotransmitter concentration 34. This article aims to describe the complete protocol for combining tDCS (NeuroConn MR compatible stimulator) with 1H-MRS at 3 T using a MEGA-PRESS sequence. We will describe the impact of a protocol that has shown great promise for the treatment of motor dysfunctions after stroke, which consists of bilateral stimulation of primary motor cortices 27,30,31. Methodological factors to consider and possible modifications to the protocol are also discussed.

This article aims to describe a basic protocol for combining transcranial direct current stimulation (tDCS) with proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) measurements to investigate the effects of bilateral stimulation on primary motor cortex metabolism.

השימוש בספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית ככלי למדידה של השפעות דו חצי מוח Transcranial חשמלי גירוי על יסודי Motor Cortex מטבוליזם

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...