עבודה זו מומנה על ידי מלגת הדיקן של אוניברסיטת סטנפורד (SEJdV), מכונים לאומיים פרס פיוניר מנהל בריאות (TRC DP0035350), פרס קרן מק &#39;נייט של Scholar (TRC) וR01 EY022638 (TRC).

1. צור זבובי Channelrhodopsin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלב-ChR2 כטב&quot;מ זבובים עם Gal4 נהג על פי בחירתך, אנו משתמשים G105-Gal4, המתבטא בנוירונים-1 Foma באונה האופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלול את האפשרות של תגובה חזותית לאור הגירוי הכחול, שני הקווים, הזבוב נמצאים בaw + רקע norpA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאת סיום: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מבוגר זבובי eclose, לשים נקבות נבחרו על מזון טרי, בתוספת 10 מיקרומטר כל טרנס רשתית (שיתוף גורם נדרש לChR2) ומוגנים מפני אור, במשך 3 ימים לפני ביצוע הבדיקה התנהגותית. </li></ol> 2. הפוך 10 מזון משופר-All-טרנס רשתית מיקרומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 100 מ&quot;ג כל טרנס הרשתית ב17.6 מ&quot;ל של אתנול 95% כדי 20 מ&quot;מ רשתית. ממשיך כל טרנס הרשתית מוגנת מפני אור בכל העת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס אוכל זבוב קמח תירס רגיל במיקרוגל, ומצנן עד חמים למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב 50 μl של 20 מ&quot;מכל טרנס רשתית לבקבוקונים של 10 מ&quot;ל של אוכל לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו בקבוקונים לצנן ולשמור מוגנים מפני אור. </li></ol> 3. ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפי Pipet: 1000 טיפי pipet μl סטנדרטיים הם חתכו ליד הקצה, יצירת קוטר נקבובי של ~ 2.25 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטפורמה (ראה תרשים 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיס Delrin, 17 סנטימטרי X 25 סנטימטר, נבנה עם חורי הברגה בכל פינה כדי להתאים ¼ &quot;מחברי צינור קירור NPT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל אנכי, עשוי מDelrin, מחובר למרכז הבסיס. המידות הכוללות הן 25 מ&quot;מ X 40 מ&quot;מ X 65 מ&quot;מ (רוחב X עומק X גובה). חריץ רחב 10 מ&quot;מ לכל האורך של המחזיק, עם בורג אגודל בתחתית. פלטפורמה מחוברת לראשו של הבעל, 25 מ&quot;מ X 40 מ&quot;מ X 10 מ&quot;מ, עם חור בקוטר 3.5 מ&quot;מ מיושר עם החריץ במחזיק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי LED (ראה תרשים 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבע זרועות של צינור נוזל קירור, ארוך ~ 18 סנטימטרים, הם מודבקים לפלטפורמת basדואר משתמש במחבר צינור נוזל הקירור. צינור נוזל קירור משמש רק כתמיכה מבנית ואינו משמש למטרות קירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חריצים כראוי רווח נחתכים לחלק האחרון של נוזל קירור שטיפה של כל זרוע להדביק גוף קירור לסוף כל זרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבל LED כחול Tri-כוכבים הוא רכוב לכל גוף קירור באמצעות דבק תרמי חתוך מראש. Carclo 18 ° Tri-עדשה מודבקת לכל כוכב Tri-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tri-כוכבי LED מחווטים לנהגי BuckPuck DC ואספקת חשמל כפי שצוינה. יש לנו ההגדרה מסודרת שלנו עם כל BuckPuck powering 2 Tri-כוכבים בסדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאורה של כל הארבעה LED-כוכבי Tri ב700 mA הניב קרינה של 713 ואט / מ 2 בפלטפורמה שלנו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלמה: המצלמה היא רכובה על חצובה קטנה והתמקדה בחלקו העליון של המצע. </li></ol> 4. Assay התנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לטשטש את זבובים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זבובים בודדים בטיפי pipet, באמצעות קלטת כדי לסגורשני קצוות של הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהתעוררו והזבובים פעילים בוחנים את קצה pipet, להסיר את הסרט ואת מקום pipet בחריץ בבעל אנכי. הבורג משמש כדי לאבטח את קצה pipet במקום ולסגור את החלק התחתון של הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו הזבוב בוחן את קצה pipet (בדרך כלל 30-60 שניות), להתחיל בהקלטת המצלמה ממש לפני שעולה לטוס מהקצה על גבי הפלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הזבוב התפתח על גבי הפלטפורמה, לחכות 1-2 סקו, ולהדליק נוריות הכחולות. השתמש בטיימר ידני כדי למדוד את הזמן עד הזבוב יוזם טיסה. </li></ol>

<ol>
	<li>Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulations+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Gordon, M., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Suh, G. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+an+innate+olfactory+avoidance+response+in+Drosophila.">Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila.</a> Current Biology. 17, 905-908 (2007).</li><li>Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+light+control+of+Drosophila+behaviors+through+Channelrhodopsin+2-mediated+photoactivation+of+targeted+neurons.">A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>de Vries, S., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system.">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Current Biology. 22, 353-362 (2012).</li><li>Card, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behaviors+in+insects.">Escape behaviors in insects.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).</li><li>Card, G., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+mediated+motor+planning+in+the+escape+response+of+Drosophila.">Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila.</a> Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).</li><li>Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+neuronal+pathway+for+visually+guided+escape+in+Drosophila+melanogaster.">A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).</li><li>Card, G., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+trade-offs+in+the+flight+initiation+of+Drosophila+melanogaster.">Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).</li><li>Hammond, S., O'Shea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+flight+initiation+in+the+fly.">Escape flight initiation in the fly.</a> Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution.">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> PNAS. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Bloomquist, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+putative+phospholipase+C+gene+of+Drosophila,+norpA,+and+its+role+in+phototransduction.">Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction.</a> Cell. 54, 723-733 (1988).</li><li>Gohl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+in+vivo+system+for+directed+dissection+of+gene+expression+patterns.">A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns.</a> Nature Methods. 8, 231-237 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-shifted+optogenetic+excitation:+a+tool+for+fast+neural+control+derived+from+Volvox+cateri.">Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri.</a> Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> אנחנו הוכחנו גירוי optogenetic של התנהגויות בריחה ידי רחיצת הליכת זבובים באור כחול בהיר באופן חופשי. גישה זו ניתן להתאים בקלות כדי לבחון התנהגויות אחרות בזבובי חופשיות הליכה, וניתן לשנותם לפלטפורמות גדולות יותר, פשוט על ידי ריצוף את מערכי LED ששמשנו אותנו על פני שטח גדו?...

ארסנל גובר של כלים גנטיים מקודדים פותח כדי לתפעל פעילות עצבית בתאים ספציפיים בדרוזופילה melanogaster 1. כלים אלה מאפשרים הפעלה או השתקה לא פולשנית של תאי עצב מסוימים בחיים השלמים ונעו בחופשיות. בין אלה, Channelrhodopsin2 (ChR2), ערוץ קטיון אור פעיל, מציע יתרונות חשובים, שכן הוא יכול להיות נשלט באופן זמני ומושרה במהירות. כאשר נוירונים ההמפורש ChR2 נחשפים לאור בהיר כחול (470 ננומטר) שהם במהירות depolarize ולהציג שיעורי ירי גבוה 3-5. הפעלה ממוקדת כגון תאי עצב ספציפי בבעלי חיים שנעו בחופשיות חשפה את התלות של נוירונים מסוימים להתנהגויות כגון הימנעות 2 CO 3, חוטם 2,4 הארכה, ותגובות בהלה בתיווך ענקי בסיבי 4. עם זאת, כמקורות האור החזקים הדרושים כדי לעורר ChR2 גם לעורר photoreceptors, החלת אופטכניקות togenetic למערכת הראייה היו מוגבלות. על ידי שילוב של גישת optogenetic עם מוטציה הפוגעת phototransduction, אנו מראים כי הפעלה של אשכול ספציפי של תאי עצב באונה האופטית של הזבוב יכולה לנהוג התנהגות הבריחה המשמשת למניעת התנגשות 6. רוב, אם לא כל, חיות חזותיות מפגינות התנהגות בריחה כדי למנוע התנגשויות עם אובייקטים מתקרבים. הליכה או נייח זבובים, כאשר הציגו עם התנגשות ממשמשת ובאה, המראה לטיסה, הרחק מההתנגשות המתקרבת 7-9. המראות אלו מאופיינים בכנפיים לפני ההמראה ומסלול טיסה יציבה 10,11 שהועלו. תגובה זו שונה מהתגובה ענקית בסיבי תיווך הלה, הקפיצות שלא קדמו להם כנפיים שהועלו, ובדרך כלל תוצאה של נפילה בנפילה חופשיה-4,9. לאחר זיהה אשכול ספציפי של תאי עצב רגיש נול באונה האופטית, Foma-1 נוירונים, שהם uniquאיליי מכוון כדי לקודד אובייקטים מתקרבים, בקשו לחקור את מעורבותם בהתנהגות בריחת נולו של הזבוב. כאן אנו מדגימים את שימוש optogenetics סלקטיבי להפעלת הנוירונים האלה וגרם להתנהגות בריחתו של הזבוב. אנו משתמשים במערכת activator תעתיק Gal4-כטב&quot;מ לנהוג ביטוי של ChR2 בנוירונים Foma-1. ChR2 דורש cofactor כל טרנס הרשתית וזה נמצא ברמות נמוכות במערכת העצבים המרכזית תסיסנית יש להשלימו בתזונה של הזבובים. 3,4 כאור בהיר משמש להפעלת ChR2 וזבובים מפגינים התנהגויות phototactic חזקות 12, שבקשנו לשלול את האפשרות של תגובה לגירוי ויזואלי. כדי לעשות זאת, השתמש בעלי חיים שהיו מוטצית הומוזיגוטים לאלל ריק של גן norpA, אשר מקודד מרכיב קריטי של מפל phototransduction, C-β פוספוליפאז. קולטני אור בזבובים מוטנטיים כאלה אינם מסוגלים responד להדליק 13. כדי לבדוק את גירוי optogenetic של תגובת הבריחה, אנחנו צריכים לבודד זבוב אחד ולשטוף אותו באור כחול בהיר. כדי לעשות זאת, אנו שמים זבובים בודדים בטיפי pipet. טיפ pipet אחד ממוקם בבעל מותאם אישית, כגון שזבוב geotactically יצעד טיפ ויצא על גבי פלטפורמה מלבנית. הזבוב הוא מסוגל ללכת בחופשיות על גבי פלטפורמה זו. הפלטפורמה היא מוקפת בארבעה מערכים LED כחולים, כל 3 נוריות המכילות, התמקדו בחלק העליון של הפלטפורמה. אחרי הזבוב הוא על הרציף, הנוריות מוארות, ותגובתו של הזבוב נרשמת באמצעות מצלמה במהירות גבוהה 6.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> כל טרנס הרשתית </td><td> התקדמות מדעית והכימית Inc </td><td> R3041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מפזר חום 9.2 C / W </td><td> Luxeonstar </td><td> LPD30-30B </td><td> 30 המ&quot;מ X 30 מ&quot;מימ מרובעים גבוהים </td></tr><tr><td> Carclo 18 ° Tri-עדשה </td><td> Luxeonstar </td><td> 10507 </td><td></td></tr><tr><td> רבל LED הכחול על בסיס Tri-Star </td><td> Luxeonstar </td><td> MR-B0030-20T </td><td> 470 ננומטר, 174 lm @ 700 אמפר. </td></tr><tr><td> 700 Driver mA BuckPuck DC </td><td> Luxeonstar </td><td> 3021-DE-700 </td><td></td></tr><tr><td> לרתום חיווט למנהל BuckPuck </td><td> Luxeonstar </td><td> 3021-HE </td><td></td></tr><tr><td> דבק תרמי חתוך מראש </td><td> Luxeonstar </td><td> LXT-S-12 </td><td> מאגר הקס 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> צינור נוזל הקירור snap-Loc, ¼ &quot;מזהה </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 5307K49 </td><td></td></tr><tr><td> מחבר צינור נוזל קירור snap-Loc </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 5307K39 </td><td> ¼ &quot;זכר NPT </td></tr><tr><td> אספקת מעבדת כיתת החלפת מצב תכנות כוח DC </td><td> BK Precision </td><td> 1698 </td><td></td></tr><tr><td> Exilim מצלמה </td><td> קאסיו </td><td> EX-FH20 </td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic stimulation of escape behavior in drosophila melanogaster

מספר הולך וגדל של כלים גנטיים מקודדים הופכים זמין המאפשר מניפולציה לא פולשנית של הפעילות העצבית של הנוירונים ספציפיים בדרוזופילה melanogaster 1. ראשי בין אלה הם כלי optogenetic, המאפשרים הפעלה או ההשתקה של תאי עצב מסוים בחיים השלמים ונעו בחופשיות באמצעות אור בהיר. Channelrhodopsin (ChR2) הוא ערוץ קטיון אור פעיל, שכאשר מופעלים על ידי אור כחול, גורם לאובדן קיטוב של נוירונים שמבטאים אותו. ChR2 היה יעיל לזיהוי תאי עצב קריטיים להתנהגויות ספציפיות, כגון הימנעות 2 CO, סיומת חוטם ותגובה בהלה תיווך ענקי בסיבי 2-4. עם זאת, כמקורות האור החזקים המשמשים כדי לעורר ChR2 גם לעורר photoreceptors, טכניקות optogenetic אלה לא עודכנה בעבר בשימוש במערכת הראייה. כאן, אנו משלבים גישת optogenetic עם מוטציה הפוגעת phototransduction להדגמהnstrate כי הפעלת מקבץ של נוירונים נול רגישים באונה האופטית של הזבוב, Foma-1 נוירונים, יכול לנהוג התנהגות בריחה המשמשת למניעת התנגשות. אנחנו השתמשנו אלל ריק של רכיב חיוני של מפל phototransduction, פוספוליפאז C-β, מקודד על ידי גן norpA, כדי להבהיר את הזבובים עיוורים וגם להשתמש במערכת activator תעתיק Gal4-כטב&quot;מ לנהוג ביטוי של ChR2 בפומה-1 הנוירונים. זבובים בודדים מונחים על משטח קטן המוקפים נוריות כחולות. כאשר הנוריות מוארות, עף במהירות המראה לטיסה, באופן דומה להתנהגות מונעת חזותי נול-בריחה. אנו מאמינים כי טכניקה זו ניתן להתאים בקלות כדי לבחון התנהגויות אחרות בהעברת זבובים בחופשיות.

עיוור או זבובים להביע ChR2 או G105 הנהג לבד מצביע על שיעור נמוך של ההמראה בעקבות ההארה שלהם עם אור כחול בהיר. עיוור זבובים הציגו שיעור הזהה של המראה ללא קשר לתאורה (איור 2), המצביע על כך המראות-אלה היו ספונטניות ולא בשל תאורה עם אור כחול. כאשר ChR2 מתבטאת בFoma1 נוירונים...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

כלי optogenetic מקודד גנטי מאפשרים מניפולציה לא פולשנית של תאי עצב ספציפיים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מוח. כלים כאלה יכולים לזהות נוירונים הפעלה שדי בכך כדי לעורר או לדכא התנהגויות מסוימות. כאן אנו מציגים שיטה להפעלת Channelrhodopsin2 המתבטאת בתאי עצב ממוקדים בזבובי חופשיות הליכה.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

optogenetic-stimulation-of-escape-behavior-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

17.3K Views.  Stanford University. כלי optogenetic מקודד גנטי מאפשרים מניפולציה לא פולשנית של תאי עצב ספציפיים ב דרוזופילה מוח. כלים כאלה יכולים לזהות נוירונים הפעלה שדי בכך כדי לעורר או לדכא התנהגויות מסוימות. כאן אנו מציגים שיטה להפעלת Channelrhodopsin2 המתבטאת בתאי עצב ממוקדים בזבובי חופשיות הליכה...

Video: Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש

כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים