כדי להתחיל, שטפו את תאי ה- iPSC המתורבתים עם PBS או DPBS של Dulbecco. ולהוסיף מיליליטר אחד של תערובת proteolytic ו collagenolytic. דוגרים על התבשיל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי לנתק את התאים.
לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש כדי לעצור את התגובה. נתקו את התאים מצלחת תרבית התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שבע עד 10 פעמים כדי לקבל תרחיף חד-תאי. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר.
מטילים את התאים על 200xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ולשאוף את הסופר-נאנט. השהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום תרבית iPSC בתוספת 50 מיקרומולר Y27632.
כעת, השתמשו ב-10 מיקרוליטרים של תרחיף התא כדי לספור את התאים באמצעות תא נויבאואר. התאם את ריכוז תרחיף התא ל -9, 000 תאים לכל 150 מיקרוליטר באמצעות מדיום תרבית iPSC בתוספת 50 מיקרומולר Y27632. כדי ליצור גופים עובריים או EBs, נערו את צינור תרחיף התא כדי למנוע שקיעת תאים לפני זריעת 150 מיקרוליטר של תרחיף התא לתוך כל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד 96 בארות.
תרבות EBs באווירה צנועה במשך 48 שעות. בסוף הדגירה, להסיר 100 מיקרוליטר של בינוני לכל באר. והוסיפו 150 מיקרוליטר של מדיום טרי שחומם מראש ללא 27632 יו'.
צור רשת גומה של ארבע על ארבע על גבי הפרפילם על-ידי הצבת רשת הפרפילם על מדף צינורות של 0.2 מיליליטר כאשר הצד עטוף הנייר פונה כלפי מעלה. ולחצו בעדינות אצבע בכפפה על כל חור בארון התקשורת כדי להטמיע את ה-EBs במטריצת קרום המרתף. לאחר מכן הסר את הנייר וחתך את רשת הגומה מתוך ריבוע הפרפילם באמצעות מספריים כדי להתאים את גודלו כך שיתאים לצלחת תרבית תאים של 60 מיליליטר.
החזירו את הפרפילם השמוט למדף צינורות של 0.2 מיליליטר כדי לספק בסיס ליצירת טיפות מטריצת קרום המרתף. מעבירים בזהירות את ה- EBs בזה אחר זה מהבאר של צלחת התרבית לגומות הפרפילם באמצעות פיפטה עם קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר. לאחר העברת 16 EBs לרשת, קח קצה פיפטה חדש של 200 מיקרוליטר והסר את התווך שנותר מהגומות.
כעת, פיפטה טיפה אחת של מטריצת קרום מרתף על כל גומה המכילה EB אחד. קח קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר והזז במהירות את ה- EBs למרכז כל טיפה מבלי להפריע לגבולות הטיפה. מניחים את הפרפילם הפצוע עם טיפות מטריצת קרום המרתף בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. ולדגור במשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצה להתפלמר.
יתר על כן, כדי לנתק את EBs מוטבע מטריצה מן parafilm, להוסיף חמישה מיליליטר של מדיום התמיינות ללא ויטמין A לצלחת. והופכים את ריבוע הפרפילם הפוך באמצעות מלקחיים, כך שהצד עם ה- EBs פונה לתחתית המנה. נערו בזהירות את הצלחת כדי לנתק את טיפות מטריצת קרום המרתף המכילות את ה- EBs מהפרפילם.
אם חלקם עדיין מחוברים, קחו קצה של ריבוע הפרפילם באמצעות מלקחיים וגלגלו אותו במהירות לכיוון מרכז המנה מספר פעמים. לאחר מכן תרבית את האורגנואידים המוחיים על שייקר אורביטלי ב-55 סל"ד באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו-חמצני ו-95% אוויר ב-37 מעלות צלזיוס. שמור את האורגנואידים DM ללא ויטמין A עם שינויים בינוניים כל יומיים.
מוצגת תמונת שדה בהיר של אורגנואיד מוחי אנושי בן 32 יום לאחר הזריעה עם מבנים דמויי חדרים בפריפריה ומורפולוגיה קומפקטית ובריאה.
