הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי הסורק בלייזר והנח את השקופית על מחזיק השקופית. לתצוגה חזותית ורכישה של תמונה, בחרו בעדשה האובייקטיבית 20X. מתוך תוכנת confocal, בחר מצב סריקה רציפה כדי למנוע crosstalk בין BODIPY 493/503 ו- DAPI.
לאחר מכן הלהיב את למות BODIPY 493/503 באמצעות קו לייזר ארגון 488 ננומטר ואת כתם DAPI באמצעות קו לייזר 405 ננומטר. הגדר את טווחי הפליטה על 493 עד 589 ננומטר עבור BODIPY ו- 410 עד 464 ננומטר עבור DAPI. לאחר מכן, הגדר את הגדרות המיקרוסקופ על ידי התאמת גדלי המסגרות, מהירות הסריקה והממוצע הכולל מספר כפול עומק סיביות כ- 12 סיביות, כיוון כדו-כיווני, זום דיגיטלי של אזור סריקה מינוס אחד וחור סיכה מינוס יחידת שטח אחת.
התאם את הגדרות הרווח והרווח הדיגיטלי. ודא שאין פיקסלים רוויים כפי שמצוין במחוון הטווח. לאחר זיהוי מדויק של טיפות השומנים, רכשו את התמונה עם ערוצי BODIPY ו- DAPI.
ליצירת תמונות בשטח רחב, עברו לעדשה סובייקטיבית פי 10. לאחר מכן הפעל את מצב סריקת אריחים והגדר אותו ליצירת תמונות פסיפס בגודל חמש על חמש. כדי ליצור תצוגות תלת-ממדיות ואורתוגונליות, יש למרוח טיפת שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי ולשנות את עדשת האובייקט לעדשת 40X.
בחר במצב Z-stack. כוונן את מישור Z כדי להגדיר את המיקום הראשון והאחרון ללכידת תמונה, והבטח עובי פרוסה אופטית של כ- 0.5 מיקרון כדי ללכוד את כל הטיפות בפוקוס. בחר במודול ortho וצור תצוגות אורתוגונליות.
קבל תמונות תלת-ממדיות על-ידי בחירת מודול התלת-ממד לאחר מצב עיבוד שקיפות. לאחר רכישת התמונה, התחל לעבד ולנתח תמונות במישור יחיד באמצעות CellProfiler. העלה את התמונות בפורמט TIF על ידי לחיצה על מצב התמונות בפינה השמאלית העליונה של ממשק CellProfiler.
השתמש במודול שמות וסוגים כדי למיין בין טיפות BODIPY וגרעיני DAPI תמונות מוכתמות בהתבסס על שמות הקבצים. לניתוח טיפות שומנים, השתמשו רק בתמונות מוכתמות של BODIPY. התחל בניית צינור על ידי לחיצה על התאמת מודולים ובחר את מודול הצבע לאפור כדי להמיר את התמונות בקנה מידה אפור.
לאחר מכן השתמשו במודול זיהוי עצמים ראשוניים, הגדירו טיפות שומנים בין 6 ל-300 פיקסלים ומקדם תיקון סף של אחד מהם כדי לזהות טיפות שומנים בתמונות בסקאלה האפורה. למדידת עוצמת הפיקסלים של טיפות השומנים שזוהו, הוסיפו מודול מדידת עוצמת עצמים. שלב מודול אובייקטי מסנן נוסף כדי להבטיח שרק האותות החזקים ביותר מכומתים בעוד שאותות פחות אינטנסיביים אינם נכללים בניתוח טיפות השומנים הסופי.
לאחר מכן, כדי למדוד את טיפות השומנים הקשורות לנתוני הפלט, הוסף את מודול צורת גודל אובייקט המדידה. לאחר מכן הוסף מודול קווי מתאר של כיסוי כדי לכסות את הטיפה המזוהה על התמונה המקורית ובכך להבטיח שהסגמנטציה תיראה מדויקת גם בתמונה הלא מעובדת. לאחר שתסיים, הוסף מודול ייצוא לגיליון אלקטרוני ולחץ על כפתור ניתוח תמונות בפינה השמאלית התחתונה.
בהשוואה לקבוצת הביקורת, בעלי חיים שניזונו מ-HFD הציגו פרופיל דיסליפידמי בולט ועלייה עדינה ברמות הטריגליצרידים במחזור. תמונות של שטחים נרחבים חשפו טיפות שומנים מוגברות על פני הכבדים של בעלי חיים שניזונו מ-HFD. ניתוח עם CellProfiler גילה מספר מוגבר של טיפות שומנים בכבד, עוצמת פלואורסצנטיות מוגברת של BODIPY, יחס שטח של 360% וקוטר גדול יותר.
התפלגות הגודל בבעלי חיים שניזונו מ-HFD חשפה עלייה בטיפות השומנים המאקרו-שלפוחיתיות בכבד של יותר מתשעה מיקרון וירידה במיקרו-שלפוחיות של פחות משלושה מיקרון.
