ביום הראשון לאחר קישור צולב כרומטין ואיסוף גרעינים מ -5, 000 תולעי Caenorhabditis elegans בוגרות צעירות, להעביר את גלולת הגרעינים תלויה מחדש ב 450 מיקרוליטר של מים נקיים לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו לו 60 מיקרוליטר של מאגר אנזים הגבלה DPN2 10X וערבבו היטב. לדגור את הדגימות עם 15 מיקרוליטר של 10% נתרן דודציל סולפט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם תסיסה.
להרוות את התגובה על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של 20% טריטון X 100 ודגירה כפי שהודגם בעבר. Aliquot 10 מיקרוליטר מן הדגימה, כמו בקרה מעוכל, ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הוספת 400 יחידות של DPN 2 לשאר הדגימה, לדגור אותו במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה לעיכול כרומטין.
ביום השני, הוסף 200 יחידות נוספות של DPN 2 לדגימה. כדי להשלים את העיכול של הדגימה הצולבת, לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך ארבע שעות. מחממים ומנטרלים את אנזים ההגבלה על ידי דגירה של הדגימה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
אם האנזים אינו יכול להיות מנוטרל על ידי חום, להוסיף 80 מיקרוליטר של 10% נתרן דודציל סולפט ולדגור. לאחר מכן, הוסיפו 375 מיקרוליטר של 20% טריטון X 100 לדגימה וערבבו על ידי ערבול. שמור בצד aliquot 10 מיקרוליטר מן הדגימה כמו בקרת העיכול.
עבור קשירת כרומטין, להעביר את הדגימה לצינור חרוטי נקי 50 מיליליטר. כוונן את נפח הדגימה ל-5.7 מיליליטר עם מים ברמה מולקולרית וערבב על-ידי ערבול. לאחר מכן, הוסף 700 מיקרוליטר של 10 X T4 ligase buffer, ואחריו 60 יחידות של T4 DNA ligase, ודגר על הדגימה במשך הלילה ב 16 מעלות צלזיוס.
ביום השלישי, המשיכו עם עיכול חלבונים וקישור צולב הפוך. הוסיפו 30 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K לדגימת 3C ודגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם תסיסה. כדי להתחיל בטיהור ספריית 3C ביום הרביעי, הוסף 30 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר RNase A לדגימה וערבב על ידי ערבול.
לאחר הדגירה, מוסיפים שבעה מיליליטר של פניל כלורופורם לדגימות ומערבבים על ידי טלטול. צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 דקות ב 3, 270 גרם ובטמפרטורת החדר. לאסוף ולהעביר את הפאזה המימית לצינור חרוטי נקי 50 מיליליטר.
מוסיפים כמויות שוות של כלורופורם ומערבבים את הדגימה על ידי ניעור. לאחר צנטריפוגה של הדגימה שוב כפי שהודגם, מעבירים את הפאזה המימית לצינור חרוטי נקי אחר של 50 מיליליטר. הוסף 7.5 מיליליטר מים באיכות מולקולרית, 35 מיליליטר של 100% אתנול ושבעה מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר גליקוגן.
מקפיאים את הדגימה המעורבת כראוי במינוס 80 מעלות צלזיוס. בזמן שהדגימה קופאת, התחל לטהר את דגימות הבקרה על ידי התאמת נפח הפקדים ל -500 מיקרוליטר באמצעות מים ברמה מולקולרית. מוסיפים שני מיקרוליטרים של 10 מיליגרם למיליליטר RNase A ומערבבים על ידי הבהוב הצינור.
לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של כלורופורם פניל לצינורות המכילים את הפקדים ולערבב על ידי טלטול. צנטריפוגה את הצינורות. לאחר העברת הפאזה המימית לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר, מוסיפים כמויות שוות של כלורופורם.
צנטריפוגה כפי שהודגם בעבר לפני איסוף השלב המימי. לשלב המימי שנאסף, להוסיף מיליליטר אחד של אתנול ושני מיקרוליטר של מיליגרם אחד לכל מיליליטר גליקוגן. לאחר ערבוב הדגימה על ידי ניעור, לדגור אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 דקות ב 3, 270 G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 750 מיקרוליטר של 70% אתנול מצונן וצנטריפוגה. יש להשהות מחדש את הגלולה המיובשת באוויר ב-50 מיקרוליטר מים באיכות מולקולרית.
ניתן להקפיא כאן את ההשעיה אם לא להמשיך הלאה באופן מיידי. כדי להמשיך בטיהור דגימת 3C, הסר את הדגימה מהמקפיא והצנטריפוגה ב 3, 270 גרם למשך 30 דקות. מוסיפים 10 מיליליטר אתנול 70% מקורר ומפרקים את כדורית הדנ"א.
לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, יש לייבש חלקית את הדגימה באוויר בטמפרטורת החדר. Re להשעות את הגלולה ב 150 מיקרוליטר של 10 מילימולרי tris HCL ב pH 7.5 על ידי pipeting למעלה ולמטה כדי לקבל את ספריית 3C מטוהר. QPCR שבוצע על דגימת ניסוי אחת ושתי דגימות בקרה 3C עזר להפיק את נתוני יעילות העיכול.
לדגימת 3C הייתה יעילות עיכול של כ-88% בשבעת האתרים הגנומיים שנבדקו.
