Mouse Cardiac Progenitor Cell Isolation, Digestion, and Freezing

התחילו בהנחת העוברים שנותחו מנקבת העכברה ההרה בת השנתיים עד שישה חודשים שעברה המתת חסד בתווך מלא קר עם נסיוב בקר עוברי 1%. לאחר הסרת רקמת רירית הרחם, השליה ושק החלמון מהעובר תחת הגדלה פי 5, יש לנתח את אבות הלב מאזור הלב העוברי באמצעות מלקחיים. משוך את כל אזורי הלב שנותחו מחמישה עוברי עכברים בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה אותם בדלי מתנדנד, מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant, ולשטוף את הרקמה עם מיליליטר אחד של PBS כיתה תרבית רקמה. צנטריפוגו את הצינורות ב-300G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את supernatant, ולחזור על שתי שטיפות עם PBS מיליליטר אחד.

לאחר שתסיים, החלף את PBS עם 0.05% Trypsin-EDTA. צנטריפוגה ולחזור על שתי שטיפות עם 0.05% טריפסין-EDTA. כדי לעכל את הרקמה, להוסיף 50 מיקרוליטר של 0.05% Trypsin-EDTA ולחמם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש לבצע דיסוציאציה מכנית עדינה לאחר חמש דקות על ידי שאיפה של המתלה מעלה ומטה באמצעות קצה מסנן רחב פתחים. נטרל את פעילות העיכול של טריפסין על ידי הוספת 350 מיקרוליטר של תווך מלא לתאים המנותקים. מעבירים את מתלה התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.

הכינו את התאים להקפאה על ידי צנטריפוגה של תרחיף התאים הטרי. בזהירות להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום הקפאה צונן. העבירו את תרחיף התא לבקבוקון קריו מקורר מראש, והניחו את בקבוקון הקריו במיכל הקפאה מקורר מראש.

הניחו את מיכל ההקפאה על מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד שמונה שעות לפני העברתו לחנקן נוזלי לניסויי ריצוף.