כדי להתחיל, לקחת את הצעיר המסונכרן C.Elegans hermaphrodites בצינור צנטריפוגה מיקרו. הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ M9, המכיל Poloxamer 188, Pluronic F127, ושני מיקרוליטרים של מגיב ערכת צביעה לגלולת התולעת. כסו את הצינורות ברדיד אלומיניום כדי להגן על הצבעים מפני אור.
תנו לתערובת להסתובב ב-20 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז לסובב את התולעים ב 500 גרם במשך דקה אחת. לאחר מכן, להסיר את פתרון מכתים מבלי להפריע את גלולת התולעת.
שטפו את התולעים עם חיץ M9 שלוש פעמים והעבירו אותן לצלחת אגר NGM גרעינית המכילה את הטיפול המתאים. שטפו את התולעים מהצלחות לצינורות מיקרו צנטריפוגות טריים עם מיליליטר אחד של חיץ M9. לאחר מכן, לתקן את התולעים עם 1% פורמלין על קרח במשך 30 דקות.
ולשטוף את התולעים עם מיליליטר אחד של חיץ M9 שלוש פעמים כדי להסיר כל שאריות פורמלדהיד. לאחר הטלת התולעים, לשאוף את הכמות המקסימלית של supernatant, שמירה על הגלולה שלמה ב 10 מיקרוליטר של M9. לאחר מכן, כדי להכין 2.5% agarose, לשקול 0.125 גרם של agarose לתוך 10 מיליליטר borosilicate זכוכית מבחן מבחנה. מוסיפים חמישה מיליליטר של חיץ M9 וממיסים את האגרוז על ידי חימום עדין של הצינור עם מבער בונזן.
מעבירים את האגרוז המומס לאמבטיה יבשה בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס. הוסף 100 מיקרוליטר של האגרוז המומס על זכוכית כיסוי מיקרוסקופ גלוסר באמצעות קצה מיליליטר אחד. מיד, לשים עוד שקופית בניצב על טיפת agarose וליצור צורת צלב.
לאחר שתי דקות, הפרידו בעדינות בין המגלשות על ידי דחיפת זכוכית הכיסוי העליונה והותירו את כרית האגרוז על מגלשת הכיסוי התחתונה. מעבירים את התולעים על כרית האגרוז בעזרת פיפטה מזכוכית פסטר. השתמשו בפתיל העשוי ממגבון מעבדה כדי להסיר עודפי נוזלים.
לאחר מכן מכסים את התולעים בכיסוי קטן יותר ומורחים לק שקוף על הפריפריה כדי למנוע אידוי. מקם את השקופית בתיבה חשוכה כדי להגן עליה מפני אור. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצלם את התולעים תוך 24 שעות באורכי הגל המתאימים באמצעות עדשת הגדלה פי 60.
לאחר מכן, פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ לחיצה ימנית על האזור האפור. בחלון המוקפץ שמופיע, בחר רכישה. Ti2 כרית מלאה.
רכישת ND וטבלאות בדיקת מידע. תחת Ti2 full pad, בחר 60 פעמים וכוונן את ידית המיקוד העדינה של המיקרוסקופ כדי להביא את התולעים למיקוד. לאחר מכן בחר דיסק מסתובב ובחר באפשרות 16 סיביות ללא קשירה.
עבור כל מסנן פלואורסצנטי, הגדר את זמן החשיפה ל- 500 אלפיות השנייה ו- 20 אלפיות השנייה לשדה בהיר. לאחר הגדרת פרמטרים אלה, בחר הפעל כעת והמתן ליצירת תמונת הפלט כקובץ ND2.
