התחל על ידי ערבוב 200 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום עם שני מיקרוגרם של כל DNA פלסמיד אחד בנפרד בצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי אחד. חזור על פעולה זו עבור שני פלסמידים אחרים בצינורות נפרדים. ואז בצינור החדש שתיים, מערבבים 200 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום עם שישה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה ומערבבים את התוכן על ידי פיפטינג.
דוגרים על הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני ערבוב התוכן של צינור שני לצינור אחד. בצינורות נפרדים, חזור על ערבוב של שני פלסמידים אחרים עם מגיב transfection. דוגרים על התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, מבחינת טיפה, הוסיפו את קומפלקסי הטרנספקציה לצלחות ההדמיה של תרבית תאי HeLa, מה שמבטיח פיזור שווה על פני כל המנה. שעה לפני ההדמיה, פתחו את שסתום מיכל הפחמן הדו-חמצני והפעילו את בקר הסביבה עבור המיקרוסקופ. באמצעות החצים למעלה ולמטה בלוח המגע, כוונן את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת הפחמן הדו-חמצני ל-5% לחץ על הגדר בסיום.
כדי להתאים את הגדרות הלייזר, הפעל את לייזר האור הלבן על-ידי לחיצה על הכרטיסיה רכישה ובחירה באפשרות פתח סקירת לייזר. בתיבת הדו-שיח, העבר את לייזר האור הלבן למצב מופעל. הזן עוצמת לייזר כ- 85% לחץ על לחצן בקרת העירור ובחר עוצמה מרבית מהתפריט הנפתח.
התחל את הטטראתיל רודאמין אתיל אסטר לחלחל או TMRE, ניסוי על ידי הגדרת לייזר עירור ל 514 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל 524 עד 545 ננומטר עבור YFP. לאחר מכן, עבור MitoTracker אדום עמוק, הגדר את לייזר העירור ל 641 ואת חלון ספקטרום הפליטה ל 650 עד 750 ננומטר. באופן דומה, עבור TMRE, הגדר את לייזר העירור ל- 555 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 557 עד 643 ננומטר.
התחל את הגדרת רכישת התמונה על-ידי בחירה בכרטיסיה רכישה והתאמת התבנית ל- 1024 על 1024. התאם את המהירות ל- 600 בתפריט הנפתח. לאחר מכן לחץ על ממוצע קו כפתור ומהתפריט הנפתח, בחר שלושה.
הפעל סריקה דו-כיוונית והגדר את גורם הפאזה והזום ל- 22.61 ו- 1.50 בהתאמה. לאחר שתסיים, בחר את התאים בהתבסס על האות הפלואורסצנטי של YFP על ידי לחיצה על הגדרת YFP ולחיצה על Fast Live. לאחר מכן התאם את הרווח והעוצמה של YFP ולאחר מכן בחר תאים בהתבסס על האות הפלואורסצנטי של YFP.
כדי לצלם את לוח הבקרה של DMSO בניסוי TMRE, התאימו את הרווח והעוצמה של הגדרת אות TMRE כך שעוצמת הרשת המיטוכונדריאלית תהיה מעט מתחת לרוויה. שמור על עלייה ואינטנסיביות עבור TMRE קבוע. לאחר מכן התאימו את הרווח והעוצמה של הגדרת MitoTracker כך שהרשת המיטוכונדריאלית תהיה גלויה, אך עמומה.
לאחר השלמת הגדרות ההגברה והעוצמה, לחץ על התחל כדי לקבל תמונה. לרכוש תמונות של 20 תאים לכל תנאי ניסוי.
