כדי להתחיל בכימות של מדדי טיפות שומנים מוכתמים של IMAT, פתח את Confocal Stacks ב- ImageJ. פתח את ממשק המשתמש סף על-ידי בחירה באפשרות תמונה, לאחר מכן התאם ולאחר מכן סף. בממשק המשתמש, בחר Intermodes כסוג הסף וודא שהאפשרות רקע כהה נבחרה.
לאחר מכן לחץ על החל כדי להפעיל אלגוריתם סף. הפעל את אלגוריתם קו פרשת המים כדי להפריד טיפות שומנים נוגעות על-ידי בחירה באפשרות תהליך, לאחר מכן בינארי וקו פרשת מים. בחרו 'כן' בתיבת דו-שיח כדי לעבד את כל התמונות בערימה כדי להוסיף קו שחור דק המחלק אזורים גדולים יותר של לבן אחיד.
לקביעת גודל החלקיקים המרבי והמינימלי, פתחו את התמונה המקורית ושרטטו את טיפת השומנים הקטנה והגדולה ביותר המוצגת בעזרת הכלי אליפסה. לאחר מכן הוסף צורות אלה למנהל החזר ההשקעה על-ידי הקלדת T.Select Analyze ולאחר מכן Set Measurements. בתיבת הדו-שיח, בחרו בקביעות, בדקו את 'אזור בלבד' ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן בחר מדידה ממנהל החזר ההשקעה.
השתמש בשני מדידות השטח מחלון תוצאות זה כטווח הגדלים ונתח חלקיקים. כדי לזהות את אזור העניין, או ROIs, באמצעות אלגוריתם ניתוח חלקיקים. בחר נתח ולאחר מכן נתח חלקיקים.
נפתחת תיבת דו-שיח לקביעת הגדרות הבחירה. כדי להפיק את מדידות החזר ההשקעה, בחרו 'נתח', לאחר מכן 'קבע מדידות' ובחרו 'שטח', 'סנטרואיד', 'התאם אליפסה' ו'מיקום מחסנית'. לחץ על אישור. לאחר מכן בחר מדידה ממנהל החזר ההשקעה.
ניתן לבחור את הנתונים בטבלת התוצאות ולהעתיק אותם ל- Excel לצורך ניתוח נוסף. להערכה מפורטת של מדדים והתפלגות של טיפות שומנים בודדות, טיפות השומנים המסומנות באופן פלואורסצנטי של BODIPY צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ספיחת סף ופילוח צורה סיפקו מעבר ראשון טוב ליצירת ROI עבור כל טיפת שומנים.
עם זאת, היה צורך בעריכות ידניות כדי לתקן את השגיאות. טיפות שומנים עמוקות, שנראו עמומות על התמונה, ניתן להוסיף ביד באמצעות הכלי הסגלגל ב- ImageJ. ניתן לתקן קבוצה של טיפות שומנים שזוהו בטעות כהחזר השקעה יחיד גם על ידי מחיקה והחלפה של החזר ההשקעה המקורי במספר ROI חדש.
כאשר טיפת שומנים בודדת זוהתה כהחזר השקעה ייחודי במספר פרוסות, ההחזר על ההשקעה הכפול אוחד לכדי החזר השקעה יחיד.
