התחל על ידי הכנת פתרונות מלאי של כל הנוגדנים ב 2, 000 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן עבור כל נוגדן, תייגו את צינורות הדילול עם הריכוזים המתאימים שלהם, כולל שם הנוגדן. כלול גם צינור ריק עבור כל נוגדן כבקרת רכב PBS-TBN בלבד.
לאחר מכן, הוסף 75 מיקרוליטר של PBS-TBN לכל צינורות דילול הנוגדנים המסומנים כ- 500 מיקרוגרם למיליליטר ומטה, כולל צינורות הבקרה ברכב בלבד. עבור כל נוגדן, פיפטה 150 מיקרוליטר של תמיסת המניות לתוך הצינור שכותרתו 1, 000 מיקרוגרם למיליליטר. כדי ליצור סדרת דילול מלאה לכל נוגדן, העבר 75 מיקרוליטר מצינור 1, 000 מיקרוגרם למיליליטר לדילול התחתון הבא בסדרה.
לאחר מכן, סגרו את צינור הדילול שזה עתה הושלם וסובבו אותו לזמן קצר. לאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של נוגדנים מדוללים לבארות הייעודיות של צלחת מיקרוטיטר 96 בארות, ולאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של PDL1 אנושי רקומביננטי ביוטינילציה לכל באר תגובה. מכסים את צלחת המיקרוטיטר בנייר כסף או באטם דבק פלסטיק ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ניעור על שייקר צלחת מסלולית ב-600 סל"ד.
לאחר מכן, לדלל את החרוזים המצמדים PD1 האנושי רקומביננטי לריכוז של 50, 000 חרוזים למיליליטר עם PBS-TBN. הסר את צלחת התגובה microtiter 96 באר מן השייקר ולקלף את אטם צלחת דבק. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תערובת החרוזים המצומדת האנושית הרקומביננטית PD1 לכל באר.
אטמו היטב את הצלחת ודגרו במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי, המוגדר ב-600 סל"ד. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את חותם צלחת הדביק. לאחר מכן הניחו את הצלחת על מפריד הצלחת המגנטי למשך שתי דקות כדי לשתק את החרוזים.
ודא שהמגנט ולוח המיקרוטיטר מחוברים היטב. הופכים את הצלחת ומשליכים את הסופרנאטנט בזהירות. כדי לשטוף את ריאגנטים התגובה העודפת מן החרוזים, להסיר את צלחת microtiter מן מפריד צלחת מגנטית ולהוסיף 150 מיקרוליטר של PBS-TBN לכל באר.
לאחר הסרת האיטום והשתקת החרוזים כפי שהודגם יש לוודא כי המגנט ולוחית המיקרוטיטר מאובטחים ומשליכים את הסופרנטנט. עכשיו להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון עבודה SAPE לכל תגובה היטב להשעות את החרוזים על ידי pipetting. אוטמים את הצלחת ודגרים עליה במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
לאחר מכן הסר בזהירות את אטם הצלחת הדבק ברגע שהחרוזים משותקים, כמו גם המגנט והצלחת מאובטחים יחד. לזרוק בעדינות את supernatant על ידי היפוך הצלחת. כדי לשטוף את עודפי SAPE מהחרוזים, הסר את צלחת המיקרוטיטר ממחזיק הצלחת המגנטית והוסף 150 מיקרוליטר PBS-TBN לכל באר כדי להשהות מחדש את החרוזים.
לאחר מכן לשתק את החרוזים על ידי הנחת צלחת microtiter על מפריד צלחת מגנטית במשך שתי דקות. לאחר אישור כי צלחת המגנט והמיקרוטיטר מאובטחת, הפוך את הצלחת והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של מדולל מבריק סגול 421 מצומד אנטי אדם או אנטי ארנב אימונוגלובולין G לבארות שלהם.
אוטמים את הצלחת ודגרים עליה במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשתק את החרוזים ולהסיר את חותם צלחת דבק. אשרו שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מאובטחים וזרקו את הסופרנטנט.
שטפו את עודפי הנוגדנים המשניים מהחרוזים על ידי הוספת 150 מיקרוליטר PBS-TBN לכל באר כדי להשעות מחדש את החרוזים. לאחר מכן, מניחים את צלחת microtiter על מפריד צלחת מגנטית במשך שתי דקות כדי לשתק את החרוזים. אשרו שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה ואז הפכו את הצלחת וזרקו את הסופר-נטנט.
לאחר הסרת חיץ הכביסה הרביעי והאחרון, הוציאו את צלחת המיקרוטיטר ממפריד הלוחות המגנטי. באמצעות פיפטה, להשעות מחדש את החרוזים ב 100 מיקרוליטר של PBS-TBN לכל באר. לבסוף, כדי לקבוע את העוצמה הפלואורסצנטית החציונית של כל תגובה, קרא את הלוח במערכת ניתוח זרימת המדווח הכפול עם נפח השאיפה מוגדר ל -50 מיקרוליטר, ספירת חרוזים מינימלית ל -100 חרוזים, הגדרת פסק הזמן ל -40 שניות, טווח gating ל -7, 000 עד 17, 000, ומצב הפעלה לכתב הכפול.
כל ארבעת הנוגדנים הפפטידים הרב-שבטיים נגד PDL1 חסמו את האינטראקציה הרקומביננטית של PDL1 האנושי עם PD1. אחוז העיכוב של נוגדנים שונים נגד PDL1 פפטיד נע בין 48% ל 74% בריכוז הנבדק המרבי של 1, 000 מיקרוגרם למיליליטר. הנוגדן החד-שבטי החיובי atezolizumab השיג חסימה של 92% מהאינטראקציה PD1-PDL1 בריכוז המרבי הנבדק של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר.
ניתוח קשירה השוואתי של נוגדנים מועמדים המושרים על ידי PDL1 vax ל- PDL1 אנושי רקומביננטי הצביע על כך שכל ארבעת הנוגדנים הפפטידים הרב-שבטיים נגד PDL1 קשורים ל- PDL1 אנושי רקומביננטי באופן תלוי ריכוז. הנוגדן נגד PDL1(130) הראה את אות הקישור הגבוה ביותר של RH PDL1 מבין ארבעת המועמדים לנוגדנים הנגרמים על ידי PDL1 vax.
