Yeast Cell Culture and Cell Harvesting for Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification

התחילו בחיסון זני השמרים המוכשרים לבקרה ורקומבינציה מצלחות YPD לחמישה מיליליטר של מדיום YPR, והגדילו את התרבית בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס וב-200 סל"ד. לאחר מכן, הרחיבו את התרבית על ידי חיסון שני מיליליטר ל-100 מיליליטר של מדיום YPR טרי וגידולו בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס וב-200 סל"ד. עבור כל זן, יש להוציא 1, 800 מיליליטר של שמרי אוטוקלאבה מדיום פפטון, ו-200 מיליליטר של תמיסת אוטוקלאבה 20%רפינוז לשתי צלוחיות ארלנמאייר 5 ליטר.

יש לחסן כל זן שמרים בצפיפות אופטית של 0.2 ננומטר ב-600 ננומטר בתווך המתאים, ולדגור במשך כשש שעות ב-200 סל"ד, או עד שהתאים מגיעים לצפיפות האופטית הרצויה של 1.0. הוסף 200 מיליליטר של 2% גלקטוז ו 110 מיקרוליטר של גורם הזדווגות שמרים אלפא או YMFA בו זמנית כדי לעצור תאים בשלב G1 ולדגור אותו במשך שעתיים. מעבירים את מתלה התא לדלי צנטריפוגה של ליטר אחד וצנטריפוגה את הדלי ב 6, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורי התא ב-10 עד 15 מיליליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, אוטמים מזרק 25 מיליליטר עם תקע פיתוי ומניחים אותו בתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מלא במים. מעבירים את תרחיף התא למכלול המזרק.

שטפו את דליי הצנטריפוגות בחמישה מיליליטר מים מזוקקים כדי לאסוף את התאים הנותרים. לאחר מכן, צנטריפוגר את ההרכבה ב 2, 397 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. לאחר מכן הסר את תקע הפיתוי מהמזרק והוציא את התאים לחנקן נוזלי ליצירת ספגטי תא.

לבסוף, מעבירים את ספגטי התא הקפוא לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ומאחסנים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.