כדי לצפות את הצלחת ב-EME, יש לדלל את EME 1 עד 20 בקור DMEM מתקדם + לציפוי בקולגן, יש לדלל חמישה מיליגרם למיליליטר קולגן I ב-Advanced DMEM+עד 100 מיקרוגרם למיליליטר. מצפים עם הצלחת עם 200 מיקרוליטר של EME מדולל או קולגן כדי לכסות את פני הבאר לחלוטין לדגור במשך שעה עד שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי ליצור חד-שכבות, שאפו את המדיה מלוח 35 מילימטר המכיל אורגנואידים.
הוסף מיליליטר אחד של PBS ושבש את EME בבארות עם קצה P1000, צנרת למעלה ולמטה בערך 20 פעמים כדי לשחרר את כל EME. מעבירים את התוכן לצינור חרוטי 15 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של PBS לצלחת כדי לאסוף אורגנואידים נוספים ולהעביר אותם לאותו צינור חרוט.
צנטריפוגו את הדגימה ב-350 גרם למשך שתי דקות והוציאו את הסופרנטנט, כולל שאריות EME. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין לגלולת האורגנואיד ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות קצה P1000 ולהוסיף שני מיליליטר של DMEM מתקדם + כדי לנטרל טריפסין.
צנטריפוגה ב 350 G במשך חמש דקות ולשאוף את supernant לפני resuspending את הגלולה ב 4.8 מיליליטר של rIOM2D. יש לסלק עודפי EME או קולגן ב-Advanced DMEM+ מהבארות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר אורגנואידים ב-rIOM2D ו-10 מיקרומולרים Y27632 לכל באר מצופה מראש.
לאחר 4 עד 16 שעות, לאסוף את התקשורת ואת הצנטריפוגה ב 1, 000 G במשך דקה אחת. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי חדש בקוטר 15 מיליליטר ומשליכים את הכדורית. שטפו כל באר עם 300 מיקרוליטר של PBS לפני הוספת 200 מיקרוליטר של rIOM2D צנטריפוגה לכל באר.
החליפו את rIOM2D כל יומיים-שלושה, והשעו את השימוש בחד-שכבות Y27632.2D המצופות ב-EME והפכו בקלות לכדוריות קטנות כאשר EME נוסף בחזרה לחלק העליון של התאים. לעומת זאת, מצע קולגן I לא הספיק לשיקום מבנים תלת-ממדיים.
