Magnetic Separation and Negative Selection of Murine Neuronal Cultures

התחילו בצנטריפוגה של תרחיף תאי המוח המבודדים ב-300G למשך שמונה דקות. השהה מחדש את הגלולה ב 80 מיקרוליטר של HBSS עם תמיסת BSA של 0.5%. מוסיפים 20 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין שאינם תאי עצב ודוגרים.

לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של HBSS עם 0.5% BSA. לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת הצנטריפוגה ב 80 מיקרוליטר של HBSS עם 0.5% BSA. כעת הוסיפו 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד ביוטין ופיפטה כדי לערבב היטב.

לאחר הדגירה הקרה להוסיף 0.5 מיליליטר של תמיסת HBSS BSA. הגדר את המעמד לפני שטיפת העמוד עם 0.5 מיליליטר HBSS עם 0.5% BSA. לאחר מכן מניחים צינור 15 מיליליטר מתחת לטור ומעבירים 0.5 מיליליטר של תרחיף התא דרכו.

בצע שלוש שטיפות עם 0.5 מיליליטר HBSS עם תמיסת BSA של 0.5% כדי ללכוד תאים עצביים שיורית. הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו בתוך צינור חדש של 15 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של HBSS עם 0.5% BSA והשתמש בבוכנה כדי לאסוף תאים שאינם עצביים המסומנים מגנטית.

לאחר צנטריפוגת התא, השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של HBSS עם תמיסת BSA של 0.5%. ספרו את התאים בתא ספירה של נויבאואר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. נוירונים חיוביים ל-LepR החלו ליצור נוירוטים לאחר 48 שעות.

ב- DIV4 הרחבות אקסונליות הראו התקדמות בעוד תהליכים דנדריטיים החלו להופיע. ב-DIV6 תאי העצב היו מפותחים מספיק. מחקרים אימונופלואורסצנטיים הראו כי לא נצפו תאי גלייה או תאים אחרים שאינם עצביים.

האופי העצבי של התאים אושר על ידי מיקרוטובול הקשור חלבון שני צביעה. ב-DIV10 30% מהתאים החיוביים ל-LepR ביטאו POMC. קישוריות סינפטית ופונקציונליות נצפו בתרבויות כלליות המכילות אוכלוסיות עצביות היפותלמיות הטרוגניות.