Human iPSC-Derived mDA Neurons Seeding and Compound Treatment for Phenotypic Profiling

בתור התחלה, הוציאו מהמקרר את צלחת 384 הבארות המצופה מראש Poly-D-Lysine המכילה 25 מיקרוליטר למינין לבאר ואזנו את הצלחת לטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות מתחת למכסה המנוע של תרבית התא. רגע לפני הזריעה, שאפו 15 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי מכל באר באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי או פיפטה 16 ערוצים. לאחר מכן להוציא 50 מיקרוליטר של פתרון התא המכיל 300, 000 נוירונים למיליליטר לתוך כל באר.

הימנע ממילוי תאים בעמודות 1, 2, 23 ו- 24 ובשורות A, B, O ו- P כדי למזער השפעות קצה אפשריות. מלאו את הבארות שאינן בשימוש ב-80 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני.

מחממים מראש נפח מתאים של אמצעי תחזוקה מלא בטמפרטורת החדר והרחק מאור. הכינו תמיסת תרכובת מרוכזת פי 1.5 לכל הריכוזים הרצויים לבדיקה, תוך שימוש באמצעי תחזוקה מלא לדילול. באמצעות מערכת צנרת אוטומטית, להשליך 40 מיקרוליטר של מדיום לכל באר מן הצלחת המכילה נוירון, משאיר 20 מיקרוליטר של בינוני לכל באר.

לאחר מכן להוסיף 40 מיקרוליטר של 1.5 פעמים מרוכז תמיסת תרכובת לכל באר כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי. בהתאם לפרוטוקול הרצוי, נוירונים דופמינרגיים נושאי מוטציה במוח התיכון LRRK2 G2019S עברו תרבית מוצלחת במשך שישה ימים, וטופלו בדימתיל סולפוקסיד או במעכב LRRK2 קינאז. תאי העצב הוכתמו בכתם גרעיני ובנוגדנים נגד אלפא-סינוקלאין, טירוזין הידרוקסילאז ו-MAP2.