Lentiviral Packaging and Viral Titering for Genome-Scale shRNA Screens

ביום אפס צלחת 10 מיליון 293T תאים ב 30 מיליליטר של DMEM ללא אנטיביוטיקה המכילים 10% FBS בצלחת 15 סנטימטר. הכינו בסך הכל 10 מנות כאלה. למחרת, שהוא היום הראשון, לאשר כי התאים הם 80% confluent ומוכנים transfection.

ואז בצינור חרוטי 50 מיליליטר ברצף, להוסיף 600 מיקרוליטר של 0.5 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר אריזה תערובת פלסמיד ספריית ברקוד 60 מיקרוליטר. בצינור חרוטי נפרד של 15 מיליליטר מערבבים 900 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ו- 12 מיליליטר DMEM על ידי מערבולת. הוסיפו 12.9 מיליליטר של תערובת זו לתערובת הדנ"א ופשוט הזיזו כדי לשלב.

מבלי לערבב עוד, דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיליליטר מהתערובת המודגרת לכל צלחת של 15 ס"מ המכילה את תאי 293T ודגרו על התאים למשך הלילה באינקובטור תרביות רקמה. ביום השלישי, קצרו את הנגיף על ידי העברת המדיה דרך יחידת סינון של 0.2 מיקרון.

Aliquot את התסנין המכיל חלקיקים נגיפיים לתוך צינורות חרוטי 15 מיליליטר. בנוסף, הכינו חמישה אליציטוטים של מיליליטר אחד של וירוס מסונן בבקבוקוני קריו לטיטרינג נגיפי. כדי לקשור את הבריכות הלנטיוויראליות, הוסיפו 65 מיקרוליטר של פולימר קטיוני לבקבוק זכוכית סטרילי המכיל 65 מיליליטר של מצע גידול תאי גידול.

פיפטה מיליליטר אחד של הפולימר המכיל מדיה לכל באר לתוך 11 לוחות תרבית רקמה שש בארות. הבא trypsinize את תאי הגידול המעבר המוקדם. לאחר ספירת התאים בשיטה מועדפת, מעבירים את התאים ללוחות שש בארות.

הפשיר את aliquots מיליליטר אחד של lentivirus 48 שעות מהמקפיא באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הטבלה כדי להכין את הזיהום עבור כל מודול ויראלי.