בידוד והפעלה של נויטרופילים

הכינו דילול של 12 מיליליטר במדיית הפרדה של 60% ו-70% בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הכינו את השיפוע מלמטה למעלה על ידי הוספת ארבעה מיליליטר בכל פעם של דילול של 60% מעל דילול 70% באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר. לאחר מכן שכבה בזהירות 12 מיליליטר של דם heparinized על גבי שיפוע צפיפות צנטריפוגה ב 200G במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

השליכו את שכבות הפלזמה והתאים החד-גרעיניים. לאחר מכן בזהירות להעביר כ 7.5 מיליליטר של השכבה מעל גלולת אריתרוציטים לתוך שני צינורות חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב 300G במשך חמש דקות ב 19 מעלות צלזיוס.

המשיכו לשטוף את גלולת התא עם תמיסת מלח מאוזנת של הנקס או HBSS. לאחר מכן לבצע ליזה hypotonic ולהסיר את תאי הדם האדומים הנותרים. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש בעדינות את הנויטרופילים הפולימורפו-גרעיניים במאגר הנותר והעבר אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר כקרח.

לאחר מכן, להעביר שלושה aliquots אחד מיקרוליטר של השעיית התא לשקופית זכוכית נקייה. כתם עם פנאופטי מהיר כדי להעריך את המורפולוגיה של התא ואת טוהר. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ וספרו 300 תאים אקראיים בכל באר.

סמן את הנויטרופילים וסוגי תאים אחרים כדי להעריך את טוהר ההפרדה. לאחר מכן, העבירו מיקרוליטר אחד של תרחיף התא ל-49 מיקרוליטר של 0.2% צבע כחול טריפאן וספרו תאים מתים וברי קיימא באמצעות תא נויבאואר. התאימו את ריכוז התאים ל-6, 667 תאים למיקרוליטר עם 50% פלזמה אוטולוגית ו-50% HBSS בתוספת סידן ומגנזיום.

לאחר מכן לחלק את השעיית התא באופן שווה בין צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המתאימים לתנאי הבדיקה, כולל הבקרה השלילית. הכן מערכת הפעלה לכל מצב, וודא שריכוז התא הסופי נשאר על 6, 600 נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים למיקרוליטר. דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא סיבוב.