Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) Assay for Evaluating ROS Production

התחל על ידי המסת 0.0005 גרם של NBT ב 10 מיקרוליטר של DMSO. לאחר ערבול של 15 דקות, מוסיפים 90 מיקרוליטר של תמיסת מלח מאוזנת של האנק או HBSS עם סידן ומגנזיום ומיקרוליטר אחד של חומרי הבדיקה. שוב, מערבלים את הצינור עד שתי דקות.

כדי לבצע את בדיקת השקופיות של NBT, ערבבו והעבירו בעדינות שני מיקרוליטרים של נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים פעילים שהוכנו קודם לכן לשקופית זכוכית נקייה. לדגור על המגלשה בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת העבודה NBT מעל התאים.

יש לדגור שוב במשך 20 דקות, תוך הגנה מפני אור. לאחר ייבוש המגלשה, תקן אותה על ידי מריחת טיפת מתנול בכל באר למשך דקה. מכתימים את המגלשה ב-0.03 ספרנין למשך דקה נוספת.

בכל באר, לספור 100 תאים אקראיים, התמיינות נויטרופילים עם וללא משקעי פורמזן. כדי לבצע את בדיקת הספקטרופוטומטריה של NBT, ערבבו בעדינות והעבירו 90 מיקרוליטר של נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים פעילים שהוכנו בעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. לאחר מכן מוסיפים בזהירות 20 מיקרוליטר של תמיסת NBT שישה מילימולרית ודגרים על הצינור בחושך במשך 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה מוסיפים 100 מיקרוליטר של 10% SDS ווורטקס. Sonicate עם קצה סוניקט באמפליטודה של 60%, ומוסיף חמישה מחזורים של 15 שניות כל אחד ומרווחים של 15 שניות. צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך חמש דקות.

מעבירים 60 מיקרוליטר של סופרנאטנט לצלחת תחתונה שקופה בת 96 בארות ומודדים את ספיגת תוצר הסופרנאטנט ב-570 ננומטר. תוצאות הבדיקה הספקטרופוטומטרית הצביעו על כך ש-100 ננו-מולארי PMA גרם לייצור ROS מוגבר בהשוואה לקבוצות fMLP וקבוצת ביקורת. תוצאות בדיקת השקופיות של NBT אישרו את התוצאות הספקטרופוטומטריות, והראו PMA כגירוי האינטנסיבי ביותר לייצור ROS בהשוואה ל-fMLP.