Generating Kidney Organoids from Induced Pluripotent Stem Cell Suspension Culture

התחל בהסרת מדיום שלב II מתרחיף תאי iPSC ביום התרבית השביעי. עכשיו לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של DPBS. פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים לכל באר.

לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום שלב II לתאים ומערבבים היטב עד שהתאים התנתקו מפני השטח. אספו את תרחיף התא בצינור של 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגו אותו ב-400 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של מדיום שלב III. מערבבים את התמיסה בעדינות. כעת זרעו את המתלים לצלחת שש בארות עם הדבקה נמוכה ביחס של אחד לשלוש.

הניחו את הצלחת על שייקר אורביטלי באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להסיר את המדיום בתרבית התלייה, תחילה לחתוך את קצה פיפטה של מיליליטר אחד באמצעות מספריים אספטיים. לאחר מכן עצבו בעדינות את צלחת שש הבארות כדי לרכז את האורגנואידים.

לאחר מכן, שואפים את האורגנואידים עם פיפטות מוכן ומניחים אותם בצינור 15 מיליליטר, נותן להם לעמוד במשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט, וודאו שהאורגנואידים נשארים בבסיס הצינור. ואז פיפטה שלב III בינוני לתוך הצלחת.

פיפטה את התערובת כדי להשעות מחדש את האורגנואידים. החזירו את האורגנואידים לצלחת בעלת שש בארות עם הדבקה נמוכה. ממשיכים לנער את הצלחת בהדבקה נמוכה ב-60 סיבובים לדקה באינקובטור.

ביום ה-12, החלף את המדיום בתווך שלב IV. אורגנואידי הכליה מציגים מבנים דמויי צינוריות וניתן להבחין בהם בקלות בתמונות שדה בהירות לאחר 18 יום של צבירה. תאי אנדותל CD31 הושרו.

דקסטרן נלקח לתוך הצינוריות הפרוקסימליות של אורגנואידי הכליות.