Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography

כדי להתחיל להכין את רשתות מיקרוסקופ האלקטרונים לקריוטומוגרפיה תאית, הניחו את הרשת, עמוסה בסרט תמיכת פחמן מחורר במכשיר פריקה זוהר כאשר צד הפחמן של הרשת פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, זוהר לפרוק את הרשת ב 15 מיליאמפר, תחת לחץ אטמוספרי 0.39 מיליבר במשך 45 שניות. לאחר שתסיים, הנח את הרשת במיכל נקי, מרופד בנייר סינון.

לאחר מכן, העבירו את הרשת יחד עם פיברונקטין (fibronectin), מלח חוצץ פוספט או PBS, צלחות ופינצטה לארון בטיחות ביולוגית. בעזרת מיקרו פיפטה, יצקו שתי נקודות בגודל נדיב של פיברונקטין בקר על משטח סטרילי כמו מכסה של שש פלטות. ודא שהנקודות גדולות מספיק כדי לעטוף את הרשת כולה.

לאחר מכן, להשיג פינצטה חמש על 15 ולטפל בשני צידי הרשת עם תמיסת היצמדות פיברונקטין (fibronectin). לאחר הטיפול בפיברונקטין בקר, הרשת תהפוך לדביקה. געו בעדינות במשטח הלא פחמני של הרשת בתחתית באר ריקה בצלחת שש בארות ושחררו את הפינצטה לחיבור הרשת למשטח החדש.

לאחר מכן, לדגור על הרשת במשך 30 דקות בתמיסת היצמדות פיברונקטין (fibronectin). כדי למנוע מהרשתות להתייבש, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של תמיסת היצמדות על גבי הרשתות, באמצעות מיקרו פיפטה כל 15 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את תמיסת ההיצמדות העודפת עם מיקרו פיפטה.

שטפו את הרשתות על ידי הוספת טיפות PBS ישירות על גבי הרשתות, באמצעות מיקרו פיפטה פעמיים עד שלוש. יש לעקר את הרשתות תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגית למשך שעה. מקם את הרשתות קרוב ככל האפשר לקרינת UV לעיקור מקסימלי.

מנעו מהרשתות להתייבש במהלך העיקור על ידי מיקרו צנרת טיפה אחת או שתיים של PBS על גבי הרשת כל 10 דקות.