Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

לפני הקפאת רשתות מיקרוסקופ האלקטרונים המכילות את התאים, בדקו את הרשתות תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך. רשום את צפיפות התאים בכל רשת כדי להתאים את זמני הכתמים במהלך הקפאת הצלילה. מחממים שניים עד שלושה מיליליטר של מלח חוצץ פוספט או PBS בצלחת ריקה ב 37 מעלות צלזיוס.

להכנת פידוקיאלים מזהב, פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי זהב קולואידית 10 ננומטר לתוך צינור נקי של 1.5 מיליליטר. הוסף אליו שני מיקרוליטרים של אלבומין בסרום בקר והומוגניזציה על ידי מיקרו פיפטינג שוב ושוב. צנטריפוגה הצינור ב 15, 000 עד 20, 000 G במשך 15 דקות.

בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע את הגלולה באמצעות מיקרו פיפטה. השהה מחדש את הגלולה ב -50 מיקרוליטר של PBS וצנטריפוגה את הצינור שוב, כפי שהודגם בעבר. שואפים ארבעה מיקרוליטרים של הגלולה באמצעות קצה של 10 מיקרוליטר ומעבירים אותה לצינור נקי של 1.5 מיליליטר.

הגדירו את התא הסביבתי בטמפרטורה של 95% לחות ו-30 מעלות צלזיוס. בעזרת פינצטה בגודל חמש על 15, בחרו רשת ושטפו אותה באמצעות PBS. מעבירים את הרשת השטופה לפינצטה צוללת.

לאחר אבטחת הרשת, הסירו את הפינצטה בגודל חמש על 15 והחליקו את המהדק על הפינצטה הצוללת. הכניסו את הרשת למקפיא תוך שמירה על מהדק מאובטח. הוסף מיקרוליטר אחד של זהב fiducials לחלק האחורי של הרשת.

לאחר מכן הוסף שניים עד שלושה מיקרוליטרים של PBS לצד הפחמן של הרשת. השתמש בכתמים אוטומטיים כדי לכתם את החלק האחורי של הרשת לפני שתצלול לאתאן נוזלי. תמונה של אור מתאם קריותרפיה ומיקרוסקופ אלקטרונים של תאי U2OS נגועים חשפה את נוכחותם של תאים מייצרי HIV.

תמונת טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים הראתה חלקיקי HIV מרובים הניצנים מקרום הפלזמה של תאי U2OS.