כדי להתחיל, ביום האפס, מדיום התמיינות ללא סרום טרום חם או מדיום SFD המכיל ערבוב 1 ציטוקין עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מתחת למכסה מנוע סטרילי של תרבית רקמה, הוסיפו את המדיום בעל תוספת ציטוקינים Mix 1 לכל באר של צלחת דוחה תאים בעלת שש בארות. כדי להכין את התאים, שאפו את מדיום התרבית מצלחת בת שש בארות המכילה תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם או תאי IPS אנושיים.
שטפו אותם עם DPBS ולאחר מכן שאפו את DPBS. לאחר מכן, מוסיפים את מגיב הדיסוציאציה לתאים ודגרים עליהם בטמפרטורת החדר למשך דקה. לאחר שאיפה מגיב דיסוציאציה זה, לדגור על התאים במשך שלוש דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הקש על הצלחת המכילה את התאים 10 פעמים בכל צד כדי לנתק את אשכולות התאים. הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום SFD שחומם מראש והוסיפו ציטוקינים 1 לתאים לכל באר. בעזרת פיפטת מרעה, מעבירים את אשכולות התאים מכל באר לבאר אחת של צלחת דוחה התאים המכילה את התווך עם מערבבים ציטוקין 1.
לאחר הכנסת הצלחת לאינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, כמו גם מצד לצד, כדי לפזר את התוכן באופן שווה ולדגור עליו עבור גופים עובריים, או EB, היווצרות. למחרת, מערבלים את הצלחת דוחה התאים המכילה את ה- EBs כדי לאסוף אותם למרכז הבארות. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את מתלה EB מן הבארות אל צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
המתן חמש עד 10 דקות עד שה- EBs יתיישבו בתחתית הצינור. בינתיים, שטפו את הצלחות דוחות התאים במים סטריליים או DPBS כדי להסיר תאים בודדים או פסולת. הוסיפו שני מיליליטר של מדיום SFD בתוספת ציטוקינים 1 לכל באר של הצלחת.
כעת, שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מצינור הצנטריפוגה מבלי לפרוק את ה-EBs. השהה מחדש את ה- EBs בנפח המחושב של מדיום SFD המכיל ציטוקין Mix 1. הוסף מיליליטר אחד של תרחיף EB לכל באר של צלחת דוחה תאים שטופה שכבר מכילה שני מיליליטר של מדיום.
יש לדגור על הצלחת לאחר פיזור הצלחת על ידי הזזת הצלחת בעדינות כאמור. לאחר איסוף ה- EBs במרכז הבארות, מוסיפים את הכירון בצד כל באר, תוך הימנעות ממגע ישיר עם התאים, דוגרים על הבארות כפי שהודגם קודם לכן. בימים השלישי והשישי של הבידול, אספו את ה- EBs ובצעו שינויי מדיה כפי שהודגם קודם לכן ביום הראשון.
יש להשתמש במדיום SFD בתוספת מיקס 3 ציטוקינים ביום השלישי ולהשתמש במדיום SFD בתוספת מיקס 4 ציטוקינים ביום השישי. לאחר איסוף ויישוב ה- EBs מהצלחת דוחה התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, כפי שהודגם קודם לכן, שאפו את הסופרנטנט, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים לכל באר של EB שנאסף בצינור כדי להשהות מחדש את ה- EBs. לאחר מכן, להעביר מיליליטר אחד של השעיה EB זה לכל באר של צלחת דוחה תאים שטף במים.
לאחר הדגירה על הצלחת במשך 10 דקות באינקובטור, השתמש בפיפט P1000 כדי לנתק את ה- EBs בכל באר על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה לא יותר מ -10 פעמים. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של חיץ כביסה לכל באר של EBs מנותקים. אספו את התאים לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר על ידי העברתם דרך מסננת של 40 מיקרון.
לאחר ספירת התאים בתרחיף המסונן, סובבו את התאים למשך 10 דקות במשקל 300 גרם. יש להשהות מחדש את התאים ב-300 מיקרוליטר של חיץ כביסה על ידי פיפטוף עדין מספר פעמים, כדי לוודא שאין גושים. המשך לבודד את התאים החיוביים ל- CD34 באמצעות ערכת מיקרו-חרוזים CD34 בהתאם להוראות היצרן.
EBs באיכות טובה הראו קצה מוגדר ביום השני של ההתמיינות ונראו ברורים ובהירים כאשר צפו תחת מיקרוסקופ. נוכחותם של אזורים כהים יותר הצביעה על מוות תאי בתוך EBs. לאחר טיפול כירון בריכוזים משתנים ביום השני, כימות מספר התאים החיוביים ל- CD34 ביום השמיני להתמיינות גילה את תגובת קו התאים לטיפול.
ציטומטריית זרימה הראתה כי העשרה חיובית CD34 באמצעות חרוזים מגנטיים סיפקה כ 85% תאים חיוביים CD34.
