עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר המתקדם 2021 מהאגודה ההמטולוגית האירופית, פרס המחקר העולמי 2021 מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, וקרן התמיכה באסטרטגיה פנימית ISSF3 במימון קרן ברוכים הבאים ואוניברסיטת אדינבורו. אנו מודים לפיונה רוסי ממתקן ציטומטריית הזרימה על התמיכה בניתוח ציטומטריית זרימה. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.

התמיינות וגירוי מכני של תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC

<ol>
	<li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+before+birth:+clues+from+gene+knockouts+and+mutations.">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li><li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development.">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li><li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis.">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li><li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Li&#232;vre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny.">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li><li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium.">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis.">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li><li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis.">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow.">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li><li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow.">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development.">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).</li><li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition.">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).</li><li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li><li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture.">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li><li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation.">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li><li>Yang, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen:+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells.">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells.">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li><li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs.">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow.">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li><li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+generation+of+endothelial+differentiation:+Tissue-specific+ECs.">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li><li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2.">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development.">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).</li><li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth.">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing.">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li><li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow.">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מאפשר יצירה של תאי אנדותל רגישים למכנו מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים וחקר תגובתם לגירוי מכני המתווך על ידי לחץ גזירה מבוקר. פרוטוקול זה מבוסס כולו על ציטוקינים ותואם באופן מלא לריאגנטים GMP לתרגום פוטנציאלי לייצור תאים לטיפול תאי.
הנגזרת של hiPSCs מספקת למדענים מודל אינסטרומנטלי לשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית, המאפשר לחקור תהליכים שאחרת קשה לחקור in vivo24. למעשה, רקמות עובריות אנושיות הזמינות למחקר נאספות מעוברים חסרי מחזור דם, ועשויה להיות לכך השפעה משמעותית על החתימה המולקולרית הנשלטת על ידי רמזים מכניים. הגישה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה חיה ומחקר בזמן אמת של תגובת התא ללחץ גזירה. השילוב של hiPSCs עם פלואידיקה מספק מודל של מחקר המתגבר על הזמינות המוגבלת וחוסר הנגישות של רקמות העובר המתפתחות כאשר התחלת מחזור הדם מחדש ושולטת על הקמת מערכת הלב וכלי הדם 3,9,10,25.
מגבלה של הפרוטוקול היא שתאי האנדותל הנגזרים מפרוטוקול זה עשויים שלא לשקף את הזהויות השונות של תאי אנדותל שונים הקיימים ברקמות המתפתחות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ייתכן שיהיה צורך בשילוב ספציפי של ציטוקינים במהלך תהליך ההתמיינות שקדם לגירוי הנוזלי כדי להשיג את הזהות הרצויה או פנוטיפ ספציפי לרקמה26. ניתן לקבל בידוד של תת-קבוצות אנדותל באמצעות אימונופנוטיפ מעודן יותר במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה מבודד תאי אנדותל רק על סמך ביטוי CD34, ובכך מאפשר בידוד עמודות במקום מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS); זה מפחית מוות תאי ואת הסיכון של זיהום. יתר על כן, פרוטוקול זה תוכנן במיוחד כדי לחקור את התפקיד של מתח גזירה מתווך על ידי זרימה למינרית. יהיה צורך להשתמש בגישות פלואידיות חלופיות כדי לחקור את ההשפעה של רמזים מכניים אחרים, כגון מתיחה או דחיסה, או סוגים אחרים של זרימה כגון זרימה מופרעת או מופרעת.
הראינו בעבר כי תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC מחקים את הזהויות התאיות העורקיות ההטרוגניות27 בדומה לזה שנצפה באבי העורקים הגבי העוברי28,29,30. יש לכך חשיבות מיוחדת בהקשר של התפתחות כלי הדם והאפיון התאי, הידוע כנשלט על ידי מחזור הדם. מחקרים במודלים שונים הראו כי חוסר זרימת דם גורם לשינוי מפרט עורקי11,14,31. המנגנונים המחברים רמזים מכניים עם מפרט התא עדיין אינם ידועים, והצנרת המתוארת כאן מאפשרת מחקרים פונקציונליים מעודנים שלא ניתן היה לבדוק in vivo.
צינור זה מתאר את הייצור והגירוי של תאי אנדותל שמקורם בתאי גזע גזעיים גבוהים באמצעות תעלות פלואידיות זמינות מסחרית, תוך הימנעות מהצורך ביציקת המכשירים כמו בהתקני פולידימתילסילוקסאן (PDMS) הנמצאים בשימוש נרחב12. יתר על כן, השימוש בשבבי PDMS הופך את איסוף התאים המגורה למאתגר במיוחד, בעוד שעם פרוטוקול זה, ניתן לשלוף את התאים בקלות מהערוץ. זה משפר באופן משמעותי את הכוח האנליטי המאפשר ניתוח עוקב כגון ניתוחים פרוטאומיים ו transcriptomic, ציטומטריה זרימה, ובדיקות פונקציונליות, אשר עשוי להזדקק תרבית נוספת או בדיקות in vivo .

במהלך ההתפתחות העוברית, הלב הוא האיבר הראשון שביסס פונקציונליות1, עם התכווצויות ניתנות לזיהוי מהשלב המוקדם ביותר של היווצרות צינור הלב2. זרימת הדם, יחד עם הרמזים המכניים המתווכים על ידי זרימת הדם בתוך כלי השיט, שולטת בהיבטים מכריעים רבים של התפתחות מוקדמת. לפני הקמת מחזור הדם העוברי, כלי הדם מאורגנים במקלעת נימים ראשונית; עם תפקוד הלב, מקלעת זו מתארגנת מחדש לכלי דם ורידיים ועורקיים3. תפקידם של רמזים מכניים באפיון העורקים משתקף על ידי ביטוי פאן-אנדותל של סמנים עורקיים וורידיים לפני תחילת זרימת הדם4.
כוחות המודינמיים לא רק שולטים על התפתחות כלי הדם עצמם, אלא גם ממלאים תפקיד בסיסי בשליטה על היווצרות תאי הדם. תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs) יוצאים מתאי אנדותל מיוחדים הנקראים אנדותל המוגן 5,6,7,8, הנמצאים באזורים אנטומיים שונים של העוברים אך ורק בשלב המוקדם של ההתפתחות. מודלים של מחסור בלב, יחד עם מודלים במבחנה, הוכיחו כי רמזים מכניים מורים ומגבירים את ייצור HSPC מהאנדותל ההמוגן 9,10,11,12,13,14.
סוגים שונים של דינמיקת זרימה הוכחו כשולטים באופן דיפרנציאלי במחזור התא15, הידוע כחשוב הן באנדותל המוגן 16,17 והן במפרט תאי עורקים18. בסך הכל, רמזים מכניים הם גורמים קריטיים לזהות התא ולתפקודו במהלך ההתפתחות. התקנים פלואידים חדשניים במבחנה מאפשרים לנו להתגבר על המגבלות הכרוכות בחקר מכנוביולוגיה התפתחותית במהלך התפתחות הדם האנושי in vivo.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול בכתב יד זה היא לתאר, שלב אחר שלב, את צינור הניסוי לחקר ההשפעה של לחץ גזירה על תאי אנדותל אנושיים שמקורם במבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פרוטוקול זה מכיל הוראות מפורטות על התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל וזריעתם לאחר מכן לתוך שבבים נוזליים עבור פרוטוקול הגירוי. באמצעות שימוש זה, תאי אנדותל שונים במבחנה יכולים להיבדק על יכולתם לחוש את לחץ הגזירה על ידי ניתוח האוריינטציה שלהם בתגובה לזרימה. זה יאפשר למעבדות אחרות לענות על שאלות לגבי התגובה ללחץ גזירה וההשלכות התפקודיות שלה על זהויות שונות של תאי אנדותל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 Luer uncoated slide</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>IB-80186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% BSA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cited as Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspiration pipette</td>
			<td>Sardtedt</td>
			<td>86.1252.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Cited as Neuronal cell culture supplement (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS DIVA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Version 8.0.1</td>
			<td>Cited as flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Microbead kit</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>30-046-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 PE clone 4H11</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>44-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar cell-repellent surface 6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657970</td>
			<td>Cited as cell-repellent plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>13122-1mg-CAY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10&#160; cell cryopreservation</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2874-100ML</td>
			<td>Cited as Cryopreservation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td>Cited as DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPB Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
			<td>Version 10.7.1</td>
			<td>Cited as flow cytometry sanalysis oftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Cited as L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham F-12&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin</td>
			<td>Merk</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Fujifilm UK LTD</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Cited as Pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ioLight/Thisle Scientific</td>
			<td>IOL-IO-INVERT</td>
			<td>Cited as inverted in-incubator microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilised BSA&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Cited as Magnetic separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Cited as Magnetic column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6145-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notebook for pump system</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 37-41%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>F/1501/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastette</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>612398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10964</td>
			<td>Cited as Perfusion set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>Cited as Flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td></td>
			<td>Verison 9.4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>version 1.6.1</td>
			<td>Cited as Pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem cell tecchonologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Cited as Detaching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP4</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEPO</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIGF1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11-100uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL11</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-11-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL6</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>206-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhLaminin-521</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Cited as Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhSCF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHC2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhTPO</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>288-TPN-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhVEGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides: Sterile, Sterile</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>IB-10830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-CD34 SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-CD34 Nutrient Supplement&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10641-025</td>
			<td>Cited as 34 nutrient supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1000701</td>
			<td>Cited as Culture media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Cited as iRock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of fetal human vessel on-chip to study developmental mechanobiology

הלב הוא האיבר הראשון שהוקם תפקודית במהלך ההתפתחות, ובכך מתחיל את זרימת הדם בשלב מוקדם מאוד בהריון. מלבד הובלת חמצן וחומרים מזינים כדי להבטיח את גדילת העובר, זרימת הדם העוברית שולטת באירועים התפתחותיים חיוניים רבים המתרחשים בתוך שכבת האנדותל באמצעות רמזים מכניים. אותות ביומכניים גורמים לשינויים מבניים בכלי הדם, קובעים מפרט עורקי ושולטים בהתפתחות תאי גזע המטופויטיים. חוסר הנגישות של הרקמות המתפתחות מגביל את הבנת תפקיד המחזור בהתפתחות האנושית המוקדמת; לכן, מודלים במבחנה הם כלים מרכזיים לחקר מכנוביולוגיה של כלי שיט. מאמר זה מתאר פרוטוקול להבדיל תאי אנדותל מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וזריעתם לאחר מכן לתוך מכשיר נוזלי כדי לחקור את תגובתם לרמזים מכניים. גישה זו מאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאי אנדותל תחת גירוי מכני ולאחר מכן שליפה של תאי האנדותל לצורך אפיון פנוטיפי ופונקציונלי. מודל ה- in vitro שהוקם כאן יהיה חיוני להבהרת המנגנונים המולקולריים התוך-תאיים המתמרים את האיתות בתיווך רמזים מכניים, אשר בסופו של דבר מתזמרים את התפתחות כלי הדם במהלך חיי העובר האנושי.

During embryonic development, the heart is the first organ to establish functionality1, with detectable contractions from the earliest stage of endocardial tube formation2. Circulation, along with the mechanical cues mediated by the flow of blood within the vessel, controls many crucial aspects of early development. Prior to fetal circulation establishment, the vasculature is organized into a primary capillary plexus; upon cardiac functioning, this plexus reorganizes into venous and arterial vasculature3. The role of mechanical cues in arteriovenous specification is reflected by the pan-endothelial expression of arterial and venous markers before blood flow initiation4.
Hemodynamic forces not only control the development of the vasculature itself but also play a fundamental role in the control of blood cell formation. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) emerge from specialized endothelial cells called hemogenic endothelium5,6,7,8, present in different anatomical regions of the embryos exclusively in the early stage of development. Heart-deficient models, together with in vitro models, have demonstrated that mechanical cues instruct and increase HSPC production from the hemogenic endothelium9,10,11,12,13,14.
Different types of flow dynamics have been shown to differentially control the cell cycle15, known to be important in both hemogenic endothelium16,17 and arterial cell specification18. Altogether, mechanical cues are critical determinants of cell identity and function during development. Novel in vitro fluidic devices allow us to overcome the limitations involved with studying developmental mechanobiology during human blood development in vivo.
The overall goal of the protocol in this manuscript is to describe, step-by-step, the experimental pipeline to study the effect of shear stress on human endothelial cells derived in vitro from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This protocol contains detailed instructions on the differentiation of hiPSCs into endothelial cells and their subsequent seeding into fluidic chips for the stimulation protocol. Using this, different in vitro-derived endothelial cells can be tested for their ability to sense the shear stress by analyzing their orientation in response to the flow. This will allow other laboratories to address questions about the response to shear stress and its functional consequences on different endothelial cell identities.

מחבר זרקור: חקר תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC בתרבית תחת גירוי מכני בתיווך פלואיד 

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

Our research explores how mechanical cues instruct the fate of endothelial cells during development, for which we combine human-induced pluripotent stem cell differentiation with fluidic-mediated mechanical stimulation. Endothelial cells are constantly exposed to the movement of blood, so important signals are missed out in static culture, which makes this the main challenge in studying endothelial cell biology using traditional culture systems. Mechanical cues, in fact, activate many crucial signaling pathways that might be overlooked in cells cultured in static conditions.Our protocol provides an easy, step-by-step guide on how to differentiate and mechanically stimulate induced pluripotent stem-cell-derived endothelial cells. This will help many laboratories in adopting a thermic culture to easily address questions about endothelial cell behavior while under flow.

אנו מתארים כאן פרוטוקול להתמיינות ולגירוי מכנו של תאי אנדותל שמקורם בתאי גזע גזעיים גבוהים המאפשר לחקור את התגובה שלהם לרמזים מכניים (איור 1). פרוטוקול זה גורם לייצור תאי אנדותל בעלי רגישות תפקודית. אנו מספקים כאן תוצאות מייצגות ומתארים את הפנוטיפ הצפוי כדי להעריך כיצד התאים מגיבים לגירוי הציטוקינים במהלך ההתמיינות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> איור 1: סכמה של פרוטוקול התמיינות וגירוי מכני. סכמה של פרוטוקול התמיינות המראה את העיתוי של תערובות שונות של ציטוקינים, בידוד תאים CD34+ , זריעת שבב נוזלי, וניתוח סופי של תאים מעוררים מכנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
תרבות של hiPSCs חשוב להתחיל את הפרוטוקול מ-hiPSCs שגדלים נכון בתנאי התחדשות עצמית. אינדיקציה טובה לאיכות התרבות היא מהירות צמיחתם. לאחר ההפשרה, התאים עשויים להזדקק 2-3 שבועות כדי להגיע לשלב הנכון של הצמיחה שיבטיח התמיינות טובה. כאשר ניתן להעביר את התאים פעמיים בשבוע ביחס של 1:6 ולהגיע למפגש כמעט מלא, זה הזמן שבו הם מוכנים להתמיין באותו יום שבו הם צריכים לעבור.
התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל השלב הראשון של ההתמיינות, המורכב מהיווצרות גופים עובריים (EBs), תלוי בקו התא ועשוי להזדקק לאופטימיזציה מסוימת עבור קו התאים הספציפי שבשימוש. הדיסוציאציה המתוארת בשלבי פרוטוקול 1.3.2.2-1.3.2.4 ניתנת לשינוי על ידי צמצום או הרחבה של הדגירה עם מגיב הדיסוציאציה והדיסוציאציה שלאחר מכן עם פיפטת פסטר. יתר על כן, ריאגנטים דיסוציאציה אחרים יכולים לשמש לשלב זה בנוסף לדיסוציאציה פיזית של המושבות עם כלי חיתוך או קצה פיפטה P100. EBs באיכות טובה מראים קצה מוגדר ביום השני של ההתמיינות ונראים ברורים ובהירים כאשר הם נצפים באמצעות מיקרוסקופ; אזורים כהים יותר עשויים להצביע על מוות תאי בתוך EBs (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> איור 2: מורפולוגיה של גופים עובריים. (A) גופים עובריים ביום 2 המראים קצוות חיצוניים מוגדרים היטב וגודל עקבי. (B) יום 2 גופים עובריים באיכות ירודה המראים מוות תאי נרחב המוביל לפירוק המבנה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ביום השני, הוספת CHIR99021 ל-EBs מעכבת את החלבון GSK-3 וכתוצאה מכך מופעלת מסלול Wnt. לקווי תאים שונים יש תגובות שונות לטיפול ב-CHR, ויש לבדוק זאת על-ידי כימות מספר תאי CD34+ המתקבלים ביום 8 באמצעות ריכוזים שונים (איור 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> איור 3: התמיינות תאי אנדותל עם טיפולי CHIR שונים. מחויבות תאי אנדותל כומתה על ידי ציטומטריית זרימה ביום 8 להתמיינות על ידי ביטוי קרום CD34, לאחר טיפול CHIR ביום 2 ב (A) 3 μM, (B) 5 μM, ו (C) 7 μM. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בידוד תאים CD34+ חשוב לוודא כי העשרת CD34+ באמצעות החרוזים המגנטיים מספקת לפחות 80% CD34+ לאחר ביטול העמודה. כדי להבטיח טוהר מספיק, ניתן לנתח אליציטוט של תאים המתקבלים מהבידוד המגנטי על ידי ציטומטריית זרימה תוך הקפדה על שימוש בשיבוט נוגדנים שונה מזה המשמש להעשרה המגנטית. כאן, נעשה שימוש בשיבוט 4H11 ו~85% טוהר הושג לאחר העשרה (איור 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> איור 4: ביטוי ממברנה של CD34 לפני ואחרי העשרה באמצעות מיון מגנטי. יום 8 גופים עובריים מנותקים (אפור) ותאים לאחר העשרה מגנטית (ירוק) הוכתמו לביטוי CD34 ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה, מה שהדגים מיון מוצלח לאחר העשרה. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
זריעת תאים לתעלה הנוזלית בעת זריעת התאים בתעלה הפלואידית, חיוני לעקוב אחר ההידבקות וההתרבות של תאי האנדותל. לאחר הזריעה, לוקח לתאים ~5 שעות להיצמד באופן מלא לתעלה (איור 5A). ניתן לבדוק גם פתרון ציפוי חלופי לשיפור ההדבקה בשלב זה. כדי לוודא שהתאים שנבדקו רגישים למכנו ולכן מסוגלים להגיב לגירוי מכני, ניתן לבדוק את כיוון התא לאורך זמן. תאים לפני הגירוי מראים אוריינטציה אקראית (איור 5A ואיור 5C) והם מכוונים מחדש במקביל לכיוון הזרימה (איור 5B,C). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לאסוף את התאים מהתעלה כדי לבצע אנליזה במורד הזרם, לדוגמה, ציטומטריית זרימה, לחקר האימונופנוטיפ של הממברנה שלהם, ומספק את הזהות האנדותלית של התאים המגוריים (איור 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> איור 5: Mechanoresponsiveness של תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSCs . (A) שכבה משולבת של תאי CD34+ מבודדים 48 שעות לאחר הזריעה. (B) שכבה מכוונת מחדש של תאי אנדותל 3 ימים תחת תרבית דינמית. (C) ניתוח אוריינטציה של תאי אנדותל לאחר 5 ימים של תרבית דינמית. (D) פרופיל ביטוי CD34 של תאים בתרבית תחת זרימה במשך 5 ימים. (E) אחוז תאי CD34+ של אוכלוסיית תאים שנלקחו מהתעלה הנוזלית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אינקובטור הפוך; נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ריאגנטים</td>
			<td>ריכוז מלאי</td>
			<td>נפח נוסף</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr><tr><td>המדיום של Dulbecco של Iscove (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 מ"ל</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>תערובת F-12 של Ham's Nutrient (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 מ"ל</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>תוסף N-2 (100x)</td>
			<td>פי 100</td>
			<td>5 מ"ל</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>תוסף B-27 (50x)</td>
			<td>פי 50</td>
			<td>10 מ"ל</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td>
			<td>10 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>1.25 מ"ל</td>
			<td>25 מיקרוגרם/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>α-מונותיוגליצרול (MTG)</td>
			<td>11.5 מ'</td>
			<td>19.5 מיקרוליטר</td>
			<td>448.5 מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>אלבומין בסרום אנושי</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>2.5 מ"ל</td>
			<td>0.5 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>הולו-טרנספרין</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>0.75 מ"ל</td>
			<td>150 מיקרוגרם/מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: הרכב ומתכון עבור 500 מ"ל של מדיום בידול ללא סרום (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ימים של בידול</td>
			<td>תערובת ציטוקינים</td>
			<td>ציטוקין</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr><tr><td>יום 0 - 2</td>
			<td>ערבוב 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>יום 2</td>
			<td>מיקס 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>מהיום השלישי ואילך</td>
			<td rowspan="2">מערבבים 3 ו-4</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>מהיום השישי ואילך</td>
			<td rowspan="8">ערבוב 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>EPO</td>
			<td>3 U/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תערובות של ציטוקינים המשמשים להתמיינות תאי אנדותל, ימים שבהם הם מתווספים למדיום SFD וריכוז סופי.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>לחץ גזירה (dyn/cm2)</td>
			<td>זמן (ח)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>עד סוף הניסוי</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: ערכי לחץ גזירה עבור התרבות הדינמית ואורך היישום שלהם.
איור משלים S1: גיאומטריה ומידות השבב והצנרת המשמשים לפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: מדריך שלב אחר שלב עבור התוכנה השולטת במשאבת האוויר עם תיאור של כל שלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S3: מדריך לניתוח כיוון באמצעות FIJI המציג את ציור צורת התא, התאמה אליפטית ומדידה סופית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה S1: גודל יחידה, נפח תרחיף וריכוזי מלאי עבור ציטוקינים המשמשים בפרוטוקול התמיינות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying hiPSC-Derived Endothelial Cells Cultured Under Fluidic-Mediated Mechanical Stimulation at JoVE.com

מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

המחקר שלנו בוחן כיצד רמזים מכניים מנחים את גורלם של תאי אנדותל במהלך ההתפתחות, ולשם כך אנו משלבים התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית הנגרמת על ידי אדם עם גירוי מכני בתיווך פלואיד. תאי אנדותל חשופים כל הזמן לתנועת הדם, ולכן אותות חשובים מתפספסים בתרבית סטטית, מה שהופך את זה לאתגר העיקרי בחקר ביולוגיה של תאי אנדותל באמצעות מערכות תרבית מסורתיות. רמזים מכניים, למעשה, מפעילים מסלולי איתות חיוניים רבים שניתן להתעלם מהם בתאים שגודלו בתרבית בתנאים סטטיים.הפרוטוקול שלנו מספק מדריך קל, שלב אחר שלב, כיצד להבדיל ולעורר באופן מכני תאי אנדותל פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע. זה יעזור למעבדות רבות לאמץ תרבית תרמית כדי לענות בקלות על שאלות על התנהגות תאי אנדותל בזמן זרימה.

in-vitro-model-fetal-human-vessel-on-chip-to-study-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

751 Views.  University of Edinburgh. המחקר שלנו בוחן כיצד רמזים מכניים מנחים את גורלם של תאי אנדותל במהלך ההתפתחות, ולשם כך אנו משלבים התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית הנגרמת על ידי אדם עם גירוי מכני בתיווך פלואיד. תאי אנדותל חשופים כל הזמן לתנועת הדם, ולכן אותות חשובים מתפספסים בתרבית סטטית, מה שהופך את זה לאתגר ...

Video: מחבר זרקור: חקר תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC בתרבית תחת גירוי מכני בתיווך פלואיד 

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

﻿Differentiation of hiPSCs into Endothelial Cells

Differentiation of hiPSCs into Endothelial Cells  

To begin, on day zero, pre-warm serum-free differentiation medium or SFD medium containing Mix 1 cytokine to 37 degrees Celsius. Then, under a sterile tissue culture hood, add the Mix 1 cytokine-supplemented medium to each well of a cell repellent six-well plate. To prepare the cells, aspirate the culture medium from a six-well plate containing human-induced pluripotent STEM cells or human IPS cells.Wash them with DPBS followed by aspirating the DPBS. Then, add the dissociation reagent to the cells and incubate them at room temperature for a minute. After aspirating this dissociation reagent, incubate the cells for another three minutes at room temperature.Then, tap the plate containing the cells 10 times on each side to detach the cell clusters. Add one milliliter of pre-warmed Mix 1 cytokine-supplemented SFD medium to the cells per well. Using a pasture pipette, transfer the cell clusters from each well to one well of the cell repellent plate containing the medium with Mix 1 cytokine.After introducing the plate into the incubator, move it back and forth, as well as side to side, to disperse the content evenly and incubate it for embryoid bodies, or EB, formation. The next day, swirl the cell repellent plate containing the EBs to collect them into the center of the wells. Using a pasteur pipette, transfer the EB suspension from the wells to a 15-milliliter centrifuge tube.Wait five to 10 minutes for the EBs to settle at the bottom of the tube. Meanwhile, wash the cell repellent plates with sterile water or DPBS to remove single cells or debris. Add two milliliters of Mix 1 cytokine-supplemented SFD medium to each well of the plate.Now, gently aspirate the supernatant from the centrifuge tube without dislodging the EBs. Resuspend the EBs in the calculated volume of SFD medium containing Mix 1 cytokine. Add one milliliter of EB suspension to each well of the washed cell repellent plate already containing two milliliters of medium.Incubate the plate after dispersing the EBs by gently moving the plate as mentioned before. After gathering the EBs at the center of the wells, add the chiron on the side of each well, avoiding direct contact with the cells, Incubate the wells as demonstrated previously. On days three and six of differentiation, collect the EBs and perform media changes as demonstrated previously for day one.Use SFD medium supplemented with Mix 3 cytokines on day three and use SFD medium supplemented with Mix 4 cytokines on day six. After collecting and settling the EBs from the cell repellent plate into a 15-milliliter centrifuge tube, as demonstrated previously, aspirate the supernatant, then add one milliliter of cell dissociation reagent per well of EB collected in the tube to resuspend the EBs. Next, transfer one milliliter of this EB suspension to each well of the cell repellent plate washed with water.After incubating the plate for 10 minutes in the incubator, use a P1000 pipette to dissociate the EBs in each well by gently pipetting up and down no more than 10 times. Then, add five milliliters of washing buffer per well of dissociated EBs. Collect the cells into a 50-milliliter centrifuge tube by passing them through a 40-micron strainer.After counting the cells in the filtered suspension, spin the cells down for 10 minutes at 300g. Resuspend the cells in 300 microliters of washing buffer by gently pipetting a few times, ensuring no clumps are present. Proceed to isolate the CD34-positive cells using a CD34 microbead kit per the manufacturer's instructions.EBs of good quality showed a defined edge by day two of the differentiation and appeared clear and bright when observed under a microscope. The presence of darker areas indicated cell death within the EBs. Following chiron treatment with varying concentrations on day two, quantifying the number of CD34-positive cells at day eight of differentiation revealed the response of the cell line to the treatment.Flow cytometry showed that the CD34-positive enrichment using the magnetic beads provided about 85%CD34-positive cells.

התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל

Seeding CD34+ Cells into Fluidic Chips

Seeding CD34+ Cells into Fluidic Chips  

To begin, centrifuge the isolated CD34-positive cells and resuspend the cell pellet in 300 microliters of pre-warmed SFM-34 medium that is supplemented with mixed 4 cytokines, and count the cells using 10 microliters of the cell suspension. After counting and resuspending the cells in a final volume of 150 microliters cytokine-supplemented SFM-34, add 0.5 microliters of ROCK inhibitor to it. Slowly aspirate the laminin from fluidic chips by placing the tip of a P200 pipette inside the reservoir on the edge of the channel.Then add the cell suspension into the channel consistently, ensuring no bubbles are formed. Incubate the chip overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to attach the cells to the channel completely. When the endothelial cells are fully attached, aspirate the medium as described previously.Add 200 microliters of cytokine-supplemented SFM-34 into the chip. Replace the medium daily until the cells reach 90 to 100%confluency.

זריעת תאי CD34+ לתוך שבבים נוזליים

Application of Continuous Flow to Endothelial Cells: Aorta-on-a-Chip

Install the perfusion set into the unit per the manufacturer's protocol. Inside a hood, attach an empty fluidic chip to it and add cytokine supplemented SFM-34 medium to fill both reservoirs under sterile conditions. Transfer the fluidic unit to the incubator, connecting it to the pump for bubble removal and calibration.Carefully remove the fluidic unit with the connected set from the incubator and transfer it into the hood along with the chips containing the cells. Clamp the tubing on both sides of the test chip. Remove the clamped tubing from the test chip and connect the chip containing the cells to the tubing.After removing or opening the clamps, transfer the system to the incubator and connect the air pump to the fluidic unit. Remove the fluidic unit from the pump and move it into the hood. Clamp the tubing on both sides of the chip and remove the tubing from the reservoirs on the chip.After gently removing the medium from the chip, Wash the cells with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline or DPBS. Add 150 microliters of dissociation buffer and incubate for three minutes at 37 degrees Celsius. When the cells are detached, collect the dissociation buffer from one reservoir and wash the channel once with DPBS.Wash the reservoir with the washing buffer to collect the remaining cells from the chip. Finally, add one milliliter of washing buffer to the collected cells before using 10 microliters from it to count the cells. Before the stimulation, cells showed random orientation, but with stimulation, they reoriented parallel to the direction of the flow.CD34 expression profile of cells cultured under flow for five days and percentage of CD34 positive cells retrieved from the fluidic channel, showed the effectiveness of the protocol.