כדי להתחיל, מקם את מכשיר המיקרו SIM שהורכב במהדקי צינור סטריליים. תרבית את המכשיר בצלחת פטרי סטרילית גדולה. ללחות נוספת, הניחו מכסה צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא במים סטריליים.
כדי להכין את המכשיר לגידול תאים, שטפו את החדר העליון עם 100 מיקרוליטר מים. לאחר מכן, הכינו תמיסת ציפוי על ידי ערבוב קולגן ארבע, פיברונקטין בקר ומים סטריליים. מוציאים את המים מהחדר העליון ומוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי.
דוגרים על התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, להחליף את פתרון הציפוי בתא העליון עם 100 מיקרוליטר של HECSR בטמפרטורת החדר. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת HECSR בתא התחתון.
כדי לעבור, EECM-BMEC כמו תאים, להוסיף תערובת אנזימים ניתוק תאים לתאים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שמונה דקות. לאחר מכן, פיפטה את תרחיף התא ולהוסיף אותו פי ארבעה נפח של תווך האנדותל בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 200G למשך חמש דקות ולהשהות מחדש את התאים במיליליטר אחד של HECSR.
זרעו את התאים בצפיפות של 40, 000 תאים לסמ"ר בתא העליון ודגרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות כדי להקל על הידבקות התא. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום עם HECSR טרי בשני החדרים. תקן את התאים על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של 100% מתנול, מקורר במינוס 20 מעלות צלזיוס לתוך החדר התחתון ו 50 מיקרוליטר לתוך החדר העליון.
יש לדגור על המכשיר בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של PBS לתוך החדר התחתון ו 100 מיקרוליטר לתוך החדר העליון. לאחר כל כביסה, לאשר את חוסר בועות בחדר התחתון.
חסום את התאים למשך 30 דקות על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של תמיסת החסימה לתא התחתון ו -50 מיקרוליטר לתא העליון. לאחר החסימה, להחליף את נפח התא העליון עם 50 מיקרוליטר של פתרון נוגדנים ראשוני לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת PBS, להוסיף 50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית לתוך החדר העליון לדגור במשך שעה אחת מוגן מפני אור.
לאחר שטיפת PBS, להוסיף 50 מיקרוליטר של Hoechst לחדר העליון לדגור במשך שלוש דקות. לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר PBS לחדר התחתון ו -100 מיקרוליטר לחדר העליון. דמיינו את המכשיר מיד במיקרוסקופ קונפוקלי.
אתרו את חלון הממברנה באמצעות מרחק עבודה ארוך ורטוב פי 40 ועברו לתעלות פלואורסצנטיות לבדיקת צביעת Hoechst וצומת. צפיפות ישיבה אופטימלית עבור תרבית תאי HIPSC ו-BPLC תת-זרעים מודגמת כאן. היה קל יותר להבחין בתרביות הקו-תרבותיות הנגזרות מ-HIPSC בדימות ניגודיות פאזה מאשר בתרביות משותפות ראשוניות.
זריעת BPLC נמוכה גורמת לכיסוי טפילים לקוי והתגבשות בעוד אכילת יתר מובילה לקילוף שכבת הטפיל מהממברנה. בתרבית תאים שמקורה ב-HIPSC מחוסנת, נראו שתי שכבות של תאים בסמיכות, המופרדות רק על ידי ננו-קרום סיליקון ניטריד דק. בבדיקת החדירות, שונות גבוהה בחדירות תאי האנדותל שגודלו בתרבית במשך יומיים מצביעה על כך שיומיים של תרבית לא הספיקו להבשלת המחסום.
יתר על כן, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בחדירות בין המעבדות עם הבשלת המחסום מארבעה ימים ואילך.
