Ex Vivo Calcium Imaging of Flat-Mounted Rat Retina upon Electrical Stimulation

הניחו את רשתית החולדה GCaMP 5G המותקנת על MEA כאשר ה-GCL פונה לאלקטרודות על במת המיקרוסקופ. חבר את מערכת הזילוח והגדר את הפרמטרים כך שכל הזמן לחורר את האמבטיה לדוגמה עם מדיום AMS מחומצן. לאחר מכן, בדוק את הרשתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במנורת פלורסנט, מסנן FITC ומצלמת CMOS.

חפשו אזור שבו ניתן לראות אלקטרודות מעוררות ואת הפלואורסצנטיות של תאי הביטוי GCaMP. בתוכנת מכשירי מחולל הדופק, הגדר את פרמטרי הגירוי החשמלי כמו הצורה, המשרעת, משך, עיכוב הפאזה ותדירות הפולסים ליישום. חבר את המצלמה למחולל הדופק באמצעות אות הדק הפלט והגדר את מצב הלכידה של תוכנת המצלמה להדק הפעלה חיצוני.

לחץ על לחצן התחל בתוכנת המצלמה כך שהיא תמתין להדק חיצוני להפעלה. התחל את תהליך רכישת התמונה באמצעות תוכנת מחולל הדופק ושמור את התמונות שצולמו, תוך הבטחת שם הקובץ כולל את כל הפרמטרים לגירוי חשמלי שהוחלו. כעת פתח תמונה J ופלח את אזור העניין באמצעות כלי בחירת האזור, הוסף אותה למנהל החזר ההשקעה ושמור אותה כתיקיית zip באמצעות תפריט מנהל ה- ROI.

חלץ את הערך האפור הממוצע מהסומס של התא על-ידי ניווט לעוד ולחיצה על מידה מרובה. הפעל את האפשרויות למדוד את כל 600 הפרוסות ושורה אחת לכל פרוסה כדי לקבל טבלה אחת שבה עמודות תואמות להחזרי השקעה ושורות תואמות למסגרות זמן. לאחר מכן חלץ את הצנטרויד מההחזר על ההשקעה באמצעות הפקודה מדידה.

כדי לתקן את אפקט הלבנת התמונה ולמזער את הרקע, בחר כ- 15 עד 20 מסגרות מתוך מרווחי הזמן שאינם מעוררים לפני כל רצף והתאימו מסגרות אלה לעקומה ליניארית כדי להבטיח ניתוח נתונים מיטבי. עקבות הסידן של סומות התא על חמישה התפרצויות של רכבות פולס כל 10 שניות במהלך רכישת תמונה של 60 שניות מוצגות. מסגרות מהתקופות שאינן מעוררות משמשות לתיקון אפקט הלבנת התמונה.

הקשר בין הזרם הדרוש להפעלת התאים לבין המרחק מהאלקטרודה המגרה הראה כי תאים הממוקמים קרוב יותר לאלקטרודה המגרה נזקקו לערכי זרם נמוכים יותר כדי לעורר תגובה.