Thawing and Culturing Cryopreserved Blood for Cytokinesis Assay

כדי להכין את בארות התרבית, סמן את המכסה של צלחת 24 בארות עם קוד התורם A או B, את התאריך ואת המינון. הסר את בקבוקוני הקריו המכילים דם אנושי מהחנקן הנוזלי והפשיר אותם חלקית באמבט המים החמים עד להופעת גבישי קרח קטנים. לאחר מכן, במכסה מנוע זרימה למינרית, פתח בזהירות את הבקבוקון כדי למנוע מבועות אוויר להישפך בתוך הצינור.

השהה מחדש והעבר את תכולת הבקבוקון לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. תוך כדי ערבול עדין של הצינור, טיפתית, להוסיף מיליליטר אחד של PBS שחומם מראש. השתמש פיפטה P-1000 כדי לערבב PBS ודם.

לדילול ושטיפה אחידה, יש להוסיף שבעה מיליליטר PBS שחומם מראש לצינור ה-15 מיליליטר ולערבב באמצעות פיפטינג. צנטריפוגה את הדם ב 180 גרם במשך שמונה דקות. בינתיים, מלאו את הבארות הלא מסומנות של צלחת 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של PBS ומחממים מראש את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, משאיר כמיליליטר אחד בצינור מבלי להפריע את הלוח. בעזרת פיפטה, להשהות מחדש את לוח הצבעים בסופרנטנט שנותר. לאחר מכן הוסף בהדרגה שמונה מיליליטר של PBS חם לתוך הצינור כפי שהודגם קודם לכן.

צנטריפוגה את הדם resuspended. בינתיים, מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית RPMI לבארות המסומנות ומחממים מראש את הצלחת כפי שהודגם בהדגמה. לאחר הצנטריפוגה, להסיר את supernatant, משאיר כ 80 מיקרוליטר של supernatant.

לאחר מכן להוסיף 280 מיקרוליטר של סרום עגל עובר להשעות מחדש את הלוח. מעבירים 180 מיקרוליטר של תרחיף התא לבארות המסומנות. לדגור את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.