Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

כדי להתחיל להשתמש בפיפט סרולוגי, יש להסיר את מצע הגידול מבקבוק T75 המכיל 70% תרבית MDA-MB-231. הוסיפו שלושה מיליליטר טריפסין לבקבוק ודגרו בחום של 37 מעלות עם 5% פחמן דו חמצני למשך שלוש עד חמש דקות כדי לנתק את התאים מהצלוחית. לאחר מכן כדי לנטרל את טריפסין, להוסיף שלושה מיליליטר של DMEM לתוך הצלוחית.

אספו את מתלה התא בצינור צנטריפוגה וסובבו ב-400 גרם במשך ארבע דקות. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה והשהו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר PBS. באמצעות מונה תאים, לקבוע את ריכוז התא.

מעבירים שמונה פעמים 10 לתאים החמישיים לתוך צינור של 15 מיליליטר ומוסיפים PBS כדי להפוך את הנפח למיליליטר אחד. לאחר מכן להוסיף שני מיקרוליטר של CFSE לתוך הצינור ולערבב את השעיית התא ביסודיות באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד. מניחים את הצינור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור במשך 20 דקות.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של DMEM לצינור וצנטריפוגה כדי לגלול למטה את התאים המסומנים CFSE. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של DMEM. לאחר הערכה מחדש של ריכוז התא, להעביר ארבע פעמים 10 לתאים החמישיים לתוך מאגר מגיב 25 מיליליטר.

הוסף DMEM כדי להפוך את נפח שמונה מיליליטר וערבב את תרחיף התא עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לתוך כל שורה על החצי השמאלי של צלחת שחורה 96 באר. באופן דומה, הוסף מתלה תא נוקאאוט EGFR בחצי הימני של הצלחת.

כדי להבטיח פיזור תאים אחיד, הזיזו את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד על הרציף. דוגרים על הצלחת במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי שתאי הגידול יצמדו. בהתבסס על ספירות של תאי Jurkat לא מומרים ומבטאי CAR, מעבירים ארבע פעמים 10 לתאי CAR-J החמישיים למאגר של 25 מיליליטר.

הוסף DMEM למאגר לנפח סופי של שני מיליליטר. לקבלת יחס השפעה לגידול של 4:1, יש להוסיף פעמיים 10 לתאי CAR-J הרביעי לכל באר ב-100 מיקרוליטר תווך לאורך דופן הבאר מבלי להפריע לתאי הגידול המחוברים. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של DMEM לצד של בארות המכילות גידול ותאי Jurkat כדי לקבל 300 מיקרוליטר של נפח לכל באר.

הזיזו את הצלחת כפי שהודגם כדי להבטיח פיזור אחיד של תאי Jurkat על תאי הגידול. אפשרו לתרבות המשותפת להתבסס בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.