Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR-Jurkat Co-Culture with CFSE-Labeled Tumor Cells

לאחר תרבית משותפת של CAR המבטא יורקאטים עם תאי גידול המסומנים ב-CFSE, הפכו בעדינות את הצלחת על מגבת נייר והקישו כדי להשליך את הסופרנאטנטים המכילים CAR-J. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיה FluoroBrite DMEM המכילה יוד פרופידיום, או PI, לתוך הבארות מבלי להפריע לתאי הגידול הדבוקים. לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של 20% טריטון X לבאר הראשונה מכל סוג גידול, המשמש כבקרה מתה מוחלטת.

יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 דקות לפני ההדמיה. לאחר הדמיה פלואורסצנטית, השתמש באחת מבארות התאים לגידול בלבד כדי לכייל את התעלה הפלואורסצנטית הירוקה. כדי להוציא תאים בקצה הבארות, יש להקטין את מסיכת הבאר ל-98%; לזהות תאים סרטניים המסומנים ב-CFSE על התעלה הפלואורסצנטית הירוקה, ולהתאים את ערך הסף של עוצמת הפלואורסצנטיות כדי ללכוד את כל התאים בבאר.

הגדר את קוטר התא המינימלי ל- 25 מיקרומטר כדי לא לכלול פסולת שזוהתה בתעלת CFSE. לאחר מכן הפעל אובייקטים נוגעים נפרדים כדי לזהות תאים בודדים. לאחר מכן קבעו שערים להגדרת אוכלוסיות תאים חיים לעומת מתים.

בחר את התאים המסומנים בתווית CFSE וצור היסטוגרמה של ספירות על ציר y לעומת עוצמת PI ממוצעת על ציר x. התאם את ערך ציר ה- x כדי להציג בצורה טובה יותר את התאים וצייר מפצל כדי להבדיל בין תאים מוכתמים ב- PI נמוך לתאים מוכתמים ב- PI גבוה. תייגו את התאים המוכתמים ב-PI נמוך כתאים חיים.

לאחר מכן, הגדר היסטוגרמה נוספת על תאים חיים עם שטח על ציר x וספירה על ציר y. תייגו את התאים שאינם פסולת כתאים חיים גדולים. לאחר מכן צייר מפצל נוסף באמצעות הגידול רק טוב כדי ללכוד תאים ולסנן פסולת.

לאחר הפעלת הניתוח על הלוח כולו, יצא את הגיליון האלקטרוני המכיל את המספרים. התווה את ספירת התאים הגדולים כדי לקבוע את מספר תאי הגידול החיים המסומנים ב- CFSE שנותרו בבאר לאחר החשיפה ל- CAR-J. לבסוף לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA חד כיווני.

ציטוטוקסיות של CAR-J1 עלתה עם יחס השפעה לגידול גבוה יותר ויותר מ -50% הרג נצפה ביחס השפעה לגידול של ארבעה לאחד. מבני מכוניות ממוקדות EGFR עם תחומי ציר מותאמים הראו הרג ספציפי לאנטיגן נגד תאי EGFR המבטאים תאי MDA-MB-231, ולא נצפה הרג משמעותי נגד תאי נוקאאוט של EGFR. מבני CAR באו לידי ביטוי גם על תאי CD3 T שמקורם ב-PBMC.

עם זאת, לא היה ביטוי של ציר CD8 המכיל EGFR-CAR. ה-IgG הקצר הראה את העוצמה הכי פחות ציטוטוקסית נגד תאי MDA-MB-231 בהשוואה לתאי IgG ארוכים ו-IgG.