כדי להתחיל, בצלחת שש בארות, זרע מיליליטר אחד של כליה עוברית אנושית 293T תאים. הוסף שני מיליליטר של DMEM מלא. למחרת, להחליף את המדיום עם מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה כדי להכין את התאים עבור transfection.
כדי להדביק את התאים הדבקים, ראשית, הכינו את תערובת A על ידי הוספת DNA פלסמיד ל-100 מיקרוליטר של Opti-MEM. לאחר מכן, הוסף 17.5 מיקרוליטר של פוליאתילנימין ל -100 מיקרוליטר של Opti-MEM. מערבבים את תכולת המיקס A ו-B, ואז דוגרים.
במהלך הדגירה, העבירו בעדינות את הצינורית כל שלוש עד ארבע דקות כדי לשפר את הערבוב. מוסיפים את כל נפח התערובת לצלחת עם תאי HEK 293T. לאחר 16 עד 20 שעות של טרנספקציה, החלף את מדיום התרבית ב- DMEM מלא טרי.
דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני כדי לייצר את הנגיפים המדומים. לאחר 72 שעות של הדבקה, קצרו את הסופרנאטנט לתוך צינור איסוף. צנטריפוגה את supernatant ב 1, 600 גרם במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן מסננים את הסופרנאטנט דרך מסנן תאית אצטט 0.45 מיקרומטר. להפיץ 50 מיקרוליטר של DMEM מלא בבארות של צלחת 96 בארות. השאר את שורה A ריקה.
הוסף 100 מיקרוליטר של מלאי pseudovirus לבארות בשורה A.Next, פיפטה 50 מיקרוליטר של הפתרון משורה A ל- B.חזור על תהליך זה עד שורה G כדי לקבל דילולים סדרתיים. הסר את המדיום המותש מצלחת עם תאי HEK 293T ACE2 רגישים בתרבית, ושטוף את התאים עם ארבעה מיליליטר של DPBS. לאחר מכן נתק את התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין EDTA במי מלח DPBS.
עכשיו להוסיף 50 מיקרוליטר של השעיית התא הרגיש לתוך כל באר המכילה את וירוסים pseudotype. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב luciferase לכל באר.
לאחר הדגירה, מעבירים את התוכן של כל באר לתוך צלחת שחורה 96 באר. לאחר מכן קרא את הצלחת בקורא צלחות. בצלחת של 96 בארות, הוסף 50 מיקרוליטר של DMEM שלם טרי לעמודות 1 עד 10 משורות B עד H.הוסף 95 מיקרוליטר של DMEM שלם טרי לבארות המתאימות של שורה A.כעת הוסף 50 מיקרוליטר של DMEM שלם לבארות בעמודה 11 ו -100 מיקרוליטר של DMEM לעמודה 12.
פיפטה חמישה מיקרוליטרים של דגימות סרום מומתות בחום לשורה A.בעזרת פיפטה רב ערוצית, מערבבים את הדגימות בשורה הראשונה ומעבירים 50 מיקרוליטר של סרום המכיל מדיום משורה A לשורה B עד שורה H.מפזרים 50 מיקרוליטר של פסאודו-וירוס מדולל המכיל מדיום לכל באר מעמודות 1 עד 11. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך שעה. הכינו תרחיף של תאי HEK293T ACE2 רגישים בחמישה מיליליטר.
הוסף 50 מיקרוליטר של השעיית התא לכל באר, ולאחר מכן לדגור לפני ביצוע הבדיקה luciferase. דילול נמוך יותר בסרום הביא לירידה בכניסת הנגיפים לתאים. זה אושר על ידי אחוז מוגבר של נטרול.
