אנו מכירים בתרומתם של מתנדבי עובדי מערכת הבריאות. פרויקט זה נתמך על ידי המחלקה למצוינות 2023/2027, MUR, איטליה. AR ו- DZ נתמכו על ידי PRIN2022 (מימון האיחוד האירופי; הדור הבאהאיחוד האירופי)

הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי ועוקב אחר הנחיות הוועדה האתית של אוניברסיטת ורונה (פרוטוקול אישור מספר 1538). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מהנבדקים האנושיים שהשתתפו במחקר. דגימות דם שלמות נאספו ממתנדבי עובדי בריאות (HCW) שהיו בתהליך קבלת חיסונים נגד SARS-CoV-2. דגימות אלה נאספו בצינורות פלסטיק המכילים נוגדי קרישה לבידוד הבא של סרום15.
כל התהליכים הבאים חייבים להתבצע במכסה מנוע ביולוגי סוג 2, בעבודה בתנאים סטריליים. הטיפול בווירוסים חייב להתבצע בזהירות, ויש לנטרל את כל תוצרי הפסולת בתמיסת אקונומיקה מדוללת. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> איור 1: ייצוג גרפי של בדיקת נטרול. (A) ייצור PV, (B) טיטרציה PV ו-(C) בדיקת נטרול. כל ההליכים מבוצעים במכסה מנוע ביולוגי סוג 2 בתנאים סטריליים. שלב הטיטרציה (B) צריך להתבצע כדי לתקנן את רמות ההדבקה של PVs לפני השימוש בבדיקת הנטרול (C). נתון זה נוצר עם BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. ייצור PVs SARS-CoV-2 ובדיקת זיהומיות
<ol><li>זרע 5 x 105 HEK293T תאים במדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM, גלוקוז גבוה, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) בצלחת 6 בארות (6WP) כדי להגיע לצפיפות תאים מתאימה התואמת למגיב הטרנספקציה בו נעשה שימוש. במקרה של ביצוע transfection עם polyehtylenimine (PEI) (להכין את מגיב בעקבות הוראות היצרן), להבטיח כי התאים להגיע 40-60% צפיפות ביום transfection (שלב 1.3). שמור את התאים באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>לפני הטרנספקציה, החלף את מדיום התא המשומש בתווך טרי ללא אנטיביוטיקה (DMEM, גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% L-גלוטמין) כדי להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. הערה: יום לאחר הזריעה, HEK293T התאים מוכנים להדבקה.</li>
	<li>תאי HEK293T דבק Transfect עם מגיב transfection מתאים על פי הוראות היצרן. אם אתם משתמשים ב-PEI, הכינו שתי תערובות ועקבו אחר השלבים הבאים.<ol><li>להכנת תערובת A, הוסף 500 ng של פלסמיד אריזה pCMV-dR8.9116, 750 ng של פלסמיד כתב pCSFLW16, ו 450 ng של SARS-CoV-2 Spike המבטא פלסמיד ב 100 μL של מדיום סרום מופחת.</li>
		<li>להכנת תערובת B, יש להוסיף 17.5 מיקרוליטר PEI (ריכוז: 1 מ"ג/מ"ל) ל-100 מיקרוליטר של מדיום הסרום המופחת.</li>
		<li>תנו לשתי התערובות לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות. לאחר מכן, ערבבו את התוכן של שתי השפופרות יחד על ידי הוספת תערובת PEI B לתערובת DNA A.</li>
		<li>דוגרים על הצינור למשך 20-30 דקות ב-RT. מעבירים את הצינור בעדינות כל 3-4 דקות כדי לשפר את הערבוב. לבסוף, מוסיפים את התערובת לתאי HEK293T.</li>
	</ol></li>
	<li>16-20 שעות לאחר הטרנספקציה, החלף את מדיום התרבית ב- DMEM טרי ומלא. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, כדי לאפשר ייצור PVs על ידי תאים נגועים.</li>
	<li>72 שעות לאחר הטרנספקציה, קצרו את הסופרנאטנט המכיל PVs. לאחר מכן צנטריפוגה ב 1600 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת תאים ותאים מתים ולסנן אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר תאית אצטט.</li>
	<li>שלב אופציונלי: כדי להגדיל את התפוקה הסופית של טיטר PV, בצע טרנספקציות מרובות, אחסן את המדיה התאית המכילה PVs ורכז אותה באמצעות צינורות ריכוז.</li>
	<li>המשך ישירות עם השלבים הבאים ("טיטרציה PVs", סעיף 2) או aliquot את המדיום המכיל PV בצינורות מתאימים כדי לאחסן ב -80 ° C עד לשימוש. הכינו aliquot נוסף (400-500 μL) שישמש לטיטרציה. הערה: ביצוע aliquots מרובים יבטיח שחזור בין ניסויים על ידי הימנעות מחזורי הפשרה והקפאה מוגזמים.</li>
</ol>2. טיטרציה PVs
<ol><li>השתמש בתווך הטרי המכיל PV לשלבים הבאים או הפשיר את aliquot הבדיקה (שלב 1.7) כדי לבצע את הטיטרציה של הזן הנגיפי החדש. הקפאת aliquots של אותו מלאי PV יבטיח שחזור.</li>
	<li>הוסף 50 μL של DMEM מלא (או תווך שלם תואם לקו תאי היעד בשימוש) בכל הבארות של צלחת באר 96 (96WP) הדרוש כדי לבדוק לשכפל את מלאי PV, משאיר שורה "A" ריקה. הוסף 100 μL של מלאי PVs לשורה "A". בהתבסס על מספר התכשירים שיש לבדוק, השאירו עמודה אחת ללא הנגיף כבקרה "תאית בלבד" (איור 2).</li>
	<li>פיפטה 50 μL משורה A לשורה B וחזור על תהליך זה עד שורה G כדי לקבל דילול סדרתי של המלאי הראשוני. מחק את עוצמת הקול העודפת מהשורה האחרונה.</li>
	<li>נתק תאיםבאמצעות טריפסין/אתילאנדיאמין טטראצטי חומצה 1x (EDTA) במאגר הפוספט של דולבקו במי מלח 1x (DPBS 1x), לאחר הסרת המדיום המשומש ושטיפת תאים עם DPBS 1x פעמיים. הכנת תאים לצפיפות של 4 x 105 תאים / מ"ל. הערה: בפרוטוקול זה, זיהום PVs נבדק על קו התאים הרגיש HEK293T/ACE2; תאים כאלה נגזרו מ-HEK293T, שהותמרו באמצעות וקטור לנטי-ויראלי כדי לבטא קולטן ACE2.</li>
	<li>הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל באר כדי להבטיח ספירת תאים של 2 x 104 תאים לכל באר.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, למשך 48 שעות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, בצע את בדיקת לוציפראז כדי לקבל את הקריאה בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 μL של מגיב luciferase לבארות לדגור בחושך ב RT במשך 2 דקות. העבירו את התוכן של כל באר לצלחת שחורה של 96 בארות (תואמת לקורא הלוחות הזמין) וקראו את הלוחות בקורא צלחות 96 בארות. הערה: הלומינומטר המשמש לקריאת לוציפראז יפיק קובץ גיליון אלקטרוני עם הנתונים הגולמיים והלא מעובדים שישמשו לניתוח במורד הזרם (במקרה זה, קובץ Excel). ההדבקה של הנגיף תתבטא כיחידות לומינסנציה יחסית (RLU) (המתוארות בסעיף 4.1).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> איור 2: פריסה מייצגת של לוח באר 96 עבור טיטרציה PV. נפח קבוע של סופרנאטנט המכיל PV מתווסף לשורה A, עמודות 1-11, ומדולל סדרתית. העמודה האחרונה נותרת כפקד "תא בלבד". נתון זה נוצר עם BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. בדיקת נטרול
<ol><li>להפשיר סרה של חולים על קרח. יש להשבית דגימות סרום על ידי דגירה בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות.</li>
	<li>בלוח באר 96, הוסף 50 μL של DMEM טרי ושלם (או תווך שלם תואם לקו תאי היעד בשימוש) בכל אחת מהבארות הבאות: משורה B (עמודות 1-10) לשורה H (עמודות 1-10). שים 95 μL של DMEM טרי ושלם בשורה A (עמודות 1-10). הוסף 50 μL ו- 100 μL של DMEM מלא לבארות של עמודות 11 ו- 12, בהתאמה. אלה יהיו הפקדים הנגועים (בקרת וירוסים, או VC) והלא נגועים (תאים בלבד, או CC), בהתאמה (איור 3).</li>
	<li>הוסף 5 μL של דגימות סרום/פלזמה מומתות חום בשורה A (עמודות 1-10). כל מדגם יהיה כפול. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, ערבבו את הדגימות בשורה הראשונה והעבירו 50 מיקרוליטר של מדיום המכיל סרום משורה A לשורה B. חזרו על התהליך הזה עד לשורה האחרונה (איור 3). יש להשליך את 50 μL הנותרים.</li>
	<li>הפשירו את המספר הדרוש של אליציטוטים של PVs ודללו ל ≥ 104 RLU/mL. הוסף 50 μL של התווך המדולל המכיל PV לכל באר (מעמודה 1 לעמודה 11) באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להגיע לדילול 1:1 של סרום / פלזמה מומתים בחום לנגיף. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, למשך שעה אחת כדי לאפשר לנוגדנים בדגימות הסרום להיקשר לחלבון הספייק SARS-CoV-2 על PVs.</li>
	<li>הכינו לפחות 5 מ"ל תרחיף של תאים רגישים (HEK293T/ACE2) בצפיפות תאים של 4 x 105 תאים/מ"ל. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל באר ודגר ב 37 ° C ו 5% CO2, במשך 48 שעות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, בצע את קריאת בדיקת לוציפראז בהתאם להוראות היצרן, כמתואר בשלב 2.7. הערה: הלומינומטר המשמש לקריאת לוציפראז יפיק קובץ גיליון אלקטרוני (במקרה זה, .xlsx) עם הנתונים הגולמיים והלא מעובדים שישמשו לניתוח במורד הזרם (קובץ הבדיקה של לוציפראז).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> איור 3: ייצוג לוחות בהתבסס על דילול בסרום. אדום בהיר מתאים לכמות גבוהה יותר של סרום, ונתיב כחול בהיר (עמודה 11) מתאים לבקרת תאים נגועים (VC, בקרת וירוסים). נתיב כחול בהיר (עמודה 12) מתאים לתאים לא נגועים (CC, בקרת תאים). נתון זה נוצר עם BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. ניתוח טיטרציה
<ol><li>בקובץ הבדיקה Luciferase, הקצה את השמות/כותרות לדוגמאות המתאימות.</li>
	<li>הכפל את מדד RLU בגורמי הדילול (מהחלק העליון לחלק התחתון של הרשת: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) כדי לקבל RLU/mL. אם משתמשים בגורמי דילול שונים, שנו את גורמי הכפל בהתאם.</li>
	<li>חשב את הממוצע RLU/מ"ל עבור כל תכשיר PV.</li>
</ol>5. ניתוח בדיקת נטרול PVs
<ol><li>בקובץ הגיליון האלקטרוני של בדיקת Luciferase (במקרה זה, .xlsx), הקצה את הכותרות המתאימות לדגימות שנבדקו. הזן את מקדם הדילול של המדגם (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x, 5,120x). חשב את Log10 של גורמי הדילול.</li>
	<li>חשב את ה-RLU הממוצע של בקרת לא נגוע ונגוע (איור 3, עמודות 11 ו-12, בהתאמה). ערכים אלה יהיו שימושיים עבור הנורמליזציה בשלב 5.5.</li>
	<li>פתח מסמך חדש לניתוח נתונים. בחר ניתוח X/Y, הזן X כמספרים ו- Y כ - Enter 2 שכפל ערכים בעמודות משנה זו לצד זו.</li>
	<li>הזן ערכי Log10 (דילול) כמספרי X. הזן את ה- RLU הכפול של הדגימות.</li>
	<li>עבור אל נתח > נרמל > סמן בדגל את כל הדגימות באותו גיליון. הזן את הערכים הממוצעים של VC ו- CC ב - כיצד מוגדר 0%?, וכיצד מוגדר 100%?, בהתאמה. לחץ על אישור.</li>
	<li>בגליון הנתונים המנורמל, עבור אל ניתוח ניתוחי XY > > ניתוחים לא ליניאריים (התאמת עקומה). סמן בדגל את כל הדוגמאות ולחץ על אישור. עבור תגובת מינון - אינהיביציה, בחר log(inhibitor) לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה.</li>
	<li>תחת אילוץ, שנה את HillSlope ל - Must להיות קטן מ- 0.</li>
	<li>תחת פלט, סמן בדגל צור טבלת סיכום וגרף. לחץ על אישור כדי לקבל את הניתוחים הסופיים. גליון עבודה עם תבנית לניתוח מסופק בקובץ משלים 1.</li>
</ol>

הערכת נטרול סרום נגד SARS-CoV-2 עם וירוסים פסאודוטיפיים

<ol>
	<li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials.">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963 (2012).</li><li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections.">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).</li><li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-&#954;B+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway.">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-&#954;B signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).</li><li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine,+antiviral-drugs,+and+neutralizing+antibodies.">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993 (2022).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).</li><li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern:+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay.">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).</li><li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses:+current+challenges+and+perspectives.">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li><li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+pseudotypes:+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy.">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016 (2020).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fourth+generation+lentiviral+Vector:+Simplifying+genomic+gymnastics.">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li><li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71.">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116 (2013).</li><li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins:+application+in+vaccine+immunogenicity,+mAb+potency,+and+sero-surveillance+studies.">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2.">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes &amp; Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li><li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na&#239;ve.">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus na&#239;ve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).</li><li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+titration,+neutralisation,+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+(SARS-CoV-2)+lentiviral+pseudotypes.">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).</li><li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bie&#324;kowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants:+The+role+of+neutralization+assays.">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells.">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li><li>Gauger, P. C., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+virus+neutralization+assay+for+detection+and+quantitation+of+serum+neutralizing+antibodies+to+influenza+A+virus+in+swine.">Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).</li><li>Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+in+monoclonal+antibody+neutralization+of+HIV-1+pseudoviruses+and+infectious+molecular+clones.">Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).</li><li>Chen, M., Zhang, X. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+applications+of+SARS-CoV-2+pseudoviruses:+A+mini+review.">Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).</li><li>Zipeto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+immunodeficiency+virus+neutralizing+antibodies+using+fusion+complexes.">Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes.</a> Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).</li><li>WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: <a target="_blank" href="https://covid19.who.int">https://covid19.who.int</a> (2022)</li><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin.">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li><li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states.">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).</li><li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection:+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies.">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089 (2022).</li><li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination:+a+mathematical+modelling+study.">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li><li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63,+HKU1,+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms.">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58 (2023).</li><li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na&#239;ve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2.">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in na&#239;ve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).</li><li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na&#239;ve+and+previously+COVID-19-infected+individuals.">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in na&#239;ve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li><li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection.">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471 (2023).</li><li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors.">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).</li><li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+(N1-N9)+and+Influenza+B+(B/Victoria+and+B/Yamagata)+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design.">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).</li><li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays:+a+1-week+protocol.">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).</li><li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity.">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745 (2021).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

למרות ששימוש בנגיף wildtype מדמה את הזיהום בפועל, PVs לנטי-ויראליים הם אפשרות בטוחה יותר לחקור את המנגנונים הקשורים לכניסה וזיהום ויראלי ללא דרישות הבטיחות המחמירות הדרושות לעבודה עם וירוסים פתוגניים 4,20,21. PVs מורכבים מליבה נגיפית פגומה בשכפול...

וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים המשמשים במיקרוביולוגיה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח לפתוגן-פתוגן 1,2,3,4. PVs מורכבים מחלק פנימי, הליבה הנגיפית, המגנה על הגנום הנגיפי, וחלק חיצוני, הגליקופרוטאינים המעטפתיים על פני השטח של הנגיף המגדירה את הטרופיזם5. פסאודו-וירוס אינו כשיר לשכפול בתא היעד מכיוון שהוא אינו מכיל את כל המידע הגנטי ליצירת חלקיקים נגיפיים חדשים. שילוב זה של תכונות מוזרות הופך PVs חלופה בטוחה וירוס wildtype. וירוסים מסוג Wildtype, לעומת זאת, הם פתוגניים מאוד ולא ניתן להשתמש בהם במעבדות BSL 2 לניתוח6.
ההדבקה של PVs יכולה להיות מנוטרת על ידי גן reporter, בדרך כלל קידוד חלבון פלואורסצנטי (GFP, RFP, YFP) או אנזים המייצר מוצרים כימילומינסנטיים (luciferase). זה נכלל באחד פלסמידים המשמשים לייצור PV משולב בגנום של pseudovirus7.
קיימים כיום מספר סוגים של ליבות PV, כולל חלקיקים שמקורם בלנטי-ויראלי המבוססים על גנום HIV-1. היתרון הגדול של PVs מבוססי HIV-1 על פני פלטפורמות אחרות הוא תהליך האינטגרציה הפנימי שלהם בגנום תא היעד8. למרות ש- HIV-1 הוא נגיף מדבק מאוד והוא הגורם הסיבתי לאיידס, וקטורים לנטי-ויראליים אלה בטוחים לשימוש בגלל צעדי האופטימיזציה הנרחבים לאורך השנים. תנאי בטיחות אופטימליים הושגו עם הכנסת 2 וקטורים לנטי-ויראליים מהדורהשני, בהם הגנים הנגיפיים התרוקנו מבלי להשפיע על יכולות ההתמרה9. הדור השלישי והרביעי תרמו לבטיחות מוגברת של טיפול בווקטורים לנטי-ויראליים עם פיצול נוסף של הגנום הנגיפי לפלסמידיםנפרדים 10,11. הדורות האחרונים של PVs משמשים בדרך כלל לייצור וקטורים לנטי-ויראליים לריפוי גנטי.
PVs יכולים לשמש לחקר אינטראקציות בין וירוסים ותאים מארחים, הן בשלב הייצור והן בשלב הזיהום. PVs משמשים במיוחד במבחני נטרול פסאודו-וירוסים (PVNA). PVNA מאומתים באופן נרחב כדי להעריך את פוטנציאל הנטרול של סרום או פלזמה על ידי מיקוד הגליקופרוטאין הנגיפי במעטפתPV 12,13. פעילות נטרול, המתבטאת בריכוז מעכב 50 (IC50), מוגדרת כדילול של סרום/פלזמה החוסם 50% מכניסת חלקיקי הנגיפים14. בפרוטוקול זה, תיארנו את הקמתו של PVNA לבדיקת פעילות הנוגדנים נגד תסמונת נשימה חריפה חמורה - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) בסרה שנאספה לפני ואחרי קבלת מנת חיסון דחף.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10403892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>60005270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D6546 - 500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS 1x)</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism version 7</td>
			<td>graphpad dotmatics</td>
			<td>NA</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;data analysis program&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/ACE2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Victor3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH35000500</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with&#160; &#39;luminometer&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;reduced serum medium&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91 packaging plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCSFLW reporter plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>145839</td>
			<td>This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>pGBW-m4137382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steadylite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6066759</td>
			<td>In the manuscript, we replaced the commercial name with &#39;luciferase reading reagent&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1x</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0949-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pseudotyped viruses as a molecular tool to monitor humoral immune responses against sars-cov-2 via neutralization assay

וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוס מארח ולבדוק את יכולת הנטרול של דגימות בסרום, בנוסף לשימוש הידוע יותר שלהם בריפוי גנטי להעברת גן מעניין. PVs פגומים בשכפול מכיוון שהגנום הנגיפי מחולק לפלסמידים שונים שאינם משולבים ב- PVs. מערכת בטוחה ורב-תכליתית זו מאפשרת שימוש ב-PVs במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה כללית לייצור PVs לנטי-ויראליים המבוססים על שלושה פלסמידים שהוזכרו כאן: (1) פלסמיד עמוד השדרה הנושא את גן המדווח הדרוש לניטור הזיהום; (2) פלסמיד האריזה הנושא את הגנים לכל החלבונים המבניים הדרושים לייצור PVs; (3) פלסמיד ביטוי הגליקופרוטאין של מעטפת פני השטח הקובע את הטרופיזם של הנגיף ומתווך את כניסת הנגיפים לתא המארח. בעבודה זו, SARS-CoV-2 Spike הוא הגליקופרוטאין במעטפת המשמש לייצור של SARS-CoV-2 פסאודו-וירוסים פסאודו-טייפ שאינם משוכפלים.
בקצרה, תאי אריזה (HEK293T) הודבקו יחד עם שלושת הפלסמידים השונים בשיטות סטנדרטיות. לאחר 48 שעות, הסופרנאטנט שהכיל את ה-PVs נקצר, סונן ואוחסן בטמפרטורה של -80°C. ההדבקה של SARS-CoV-2 PVs נבדקה על ידי לימוד הביטוי של הגן המדווח (luciferase) בקו תא המטרה 48 שעות לאחר ההדבקה. ככל שהערך עבור יחידות לומינסנציה יחסית (RLUs) גבוה יותר, כך שיעור הזיהום/התמרה גבוה יותר. יתר על כן, PVs זיהומיות נוספו לדגימות הסרום בדילול סדרתי כדי לחקור את תהליך הנטרול של כניסת פסאודו-וירוסים לתאי המטרה, שנמדד כירידה בעוצמת RLU: ערכים נמוכים יותר המתאימים לפעילות נטרול גבוהה.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools used in microbiology to study host-virus and pathogen-pathogen interactions1,2,3,4. PVs consist of an inner part, the viral core that protects the viral genome, and an outer part, the envelope glycoproteins on the surface of the virus that defines the tropism5. A pseudovirus is replication-incompetent in the target cell because it does not contain all the genetic information to generate new viral particles. This combination of peculiar features makes PVs a safe alternative to a wildtype virus. Wildtype viruses, on the other hand, are highly pathogenic and cannot be used in BSL 2 laboratories for analysis6.
The infectivity of PVs can be monitored by a reporter gene, usually coding for a fluorescent protein (GFP, RFP, YFP) or an enzyme that produces chemiluminescent products (luciferase). This is contained in one of the plasmids used for PV production and incorporated in the genome of the pseudovirus7.
Several types of PV cores currently exist, including lentiviral-derived particles based on the HIV-1 genome. The great advantage of HIV-1-based PVs over other platforms is their intrinsic integration process in the target cell genome8. Although HIV-1 is a highly contagious virus and is the causative agent of AIDS, these lentiviral vectors are safe to use because of the extensive optimization steps over the years. Optimal safety conditions were achieved with the introduction of 2nd-generation lentiviral vectors, in which viral genes were depleted without influencing transduction capabilities9. The 3rd and 4th generations contributed to the increased safety of lentiviral vector handling with the further splitting of the viral genome into separate plasmids10, 11. The latest generations of PVs are generally employed to produce lentiviral vectors for gene therapy.
PVs can be used to study interactions between viruses and host cells, during both the production and the infection phases. PVs are especially employed in pseudovirus neutralization assays (PVNA). PVNAs are widely validated to assess the neutralization potential of serum or plasma by targeting the viral glycoprotein on the PV&#39;s envelope12,13. Neutralization activity, expressed as the inhibitory concentration 50 (IC50), is defined as the dilution of serum/plasma that blocks 50% of viral particle entry14. In this protocol, we described the set-up of a PVNA to test the antibody activity against Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sera collected before and after receiving a booster vaccine dose.

מחבר זרקור: חקר אינטראקציות וירוס מארח עם וירוסים מדומים 

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

Pseudotyped viruses are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test neutralizing activity of serum samples. In the work we present today, a general methodology to produce pseudotyped viruses, based on free plasmid, will be presented. For neutralization assays, Y-type viruses are generally used, but they are highly pathogenic and cannot be handled in a BSL-2 laboratories, rendering this system purely applicable on large scale.The technology of pseudo viruses can be a safer alternative compared to live virus to allow the study of pathogen to host interaction and to test neutralizing activity of antibodies. Future experiments will investigate the role of specific antibodies in the maintenance of immunity after vaccination using the technology of pseudo viruses.

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של SARS-CoV-2 PVs ויישום במורד הזרם של PVs אלה כדי לנתח את פעילות הנטרול של סרום / פלזמה של נבדקים שקיבלו חיסון נגדCOVID-19 17. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לייצר פסאודוטיפים של כל וריאנט דאגה SARS-CoV-2 (VOC) כדי לבחון את האבולוציה של התגובה המנטרלת. למרות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses at JoVE.com

וירוסים מדומים (PVs) הם נגיפים פגומים בשכפול המשמשים לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בתנאים בטוחים יותר מאשר טיפול בנגיפים אותנטיים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המראה כיצד ניתן להשתמש ב- SARS-CoV-2 PVs כדי לבדוק את יכולת הנטרול של נסיוב החולים לאחר חיסון COVID-19.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

וירוסים פסאודוטיפיים הם כלים מולקולריים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוס מארח ולבדוק פעילות מנטרלת של דגימות בסרום. בעבודה שאנו מציגים היום תוצג מתודולוגיה כללית לייצור וירוסים מדומים, המבוססת על פלסמיד חופשי. עבור מבחני נטרול, וירוסים מסוג Y משמשים בדרך כלל, אך הם פתוגניים מאוד ולא ניתן לטפל בהם במעבדות BSL-2, מה שהופך מערכת זו לישימה אך ורק בקנה מידה גדול.הטכנולוגיה של וירוסים מדומים יכולה להיות חלופה בטוחה יותר בהשוואה לווירוס חי כדי לאפשר לחקר הפתוגן לארח אינטראקציה ולבדוק פעילות מנטרלת של נוגדנים. ניסויים עתידיים יחקרו את תפקידם של נוגדנים ספציפיים בשמירה על חסינות לאחר החיסון באמצעות הטכנולוגיה של וירוסים מדומים.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

1.3K Views.  University of Verona. וירוסים פסאודוטיפיים הם כלים מולקולריים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוס מארח ולבדוק פעילות מנטרלת של דגימות בסרום. בעבודה שאנו מציגים היום תוצג מתודולוגיה כללית לייצור וירוסים מדומים, המבוססת על פלסמיד חופשי. עבור מבחני נטרול, וירוסים מסוג Y משמשים בדרך כ...

Video: מחבר זרקור: חקר אינטראקציות וירוס מארח עם וירוסים מדומים 

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

To begin, in a six-well plate, seed one milliliter of human embryonic kidney 293T cells. Add two milliliters of complete DMEM. The next day, replace the medium with fresh antibiotic-free medium to prepare the cells for transfection.To transfect the adherent cells, first, prepare mix A by adding plasmid DNA to 100 microliters of Opti-MEM. Next, add 17.5 microliters of polyethylenimine to 100 microliters of Opti-MEM. Mix the contents of the mix A and B, then incubate.During incubation, gently flick the tube every three to four minutes to enhance mixing. Add the whole volume of the mixture to the plate with the HEK 293T cells. After 16 to 20 hours of transfection, replace the culture medium with fresh complete DMEM.Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide to produce the pseudotype viruses. After 72 hours of transfection, harvest the supernatant into a collection tube. Centrifuge the supernatant at 1, 600 G for seven minutes at room temperature.Then filter the supernatant through a 0.45 micrometer cellulose acetate filter. Distribute 50 microliters of complete DMEM in the wells of a 96-well plate. Leave row A empty.Add 100 microliters of the pseudovirus stock to the wells in row A.Next, pipette 50 microliters of the solution from row A to B.Repeat this process up to row G to obtain serial dilutions. Remove the exhausted medium from a plate with cultured susceptible HEK 293T ACE2 cells, and wash the cells with four milliliters of DPBS. Then detach the cells with one milliliter of trypsin EDTA in DPBS saline.Now add 50 microliters of the susceptible cell suspension into each well containing the pseudotype viruses. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for 48 hours. Add 100 microliters of the luciferase reagent to each well.After incubation, transfer the contents of each well into a black 96-well plate. Then read the plate in a plate reader. In a 96-well plate, add 50 microliters of fresh complete DMEM to columns one to 10 from rows B to H.Add 95 microliters of fresh complete DMEM to the corresponding wells of row A.Now add 50 microliters of complete DMEM to the wells in column 11 and 100 microliters of DMEM to column 12.Pipette five microliters of heat-inactivated serum samples to row A.With a multi-channel pipette, mix the samples in the first row and transfer 50 microliters of medium-containing serum from row A to B up to row H.Distribute 50 microliters of dilute pseudovirus containing medium to each well from columns one to 11. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for one hour. Prepare a suspension of susceptible HEK293T ACE2 cells in five milliliters.Add 50 microliters of the cell suspension to each well, then incubate before performing the luciferase assay. Lower serum dilution resulted in decreased viral entry into the cells. This is confirmed by the increased percentage of neutralization.