Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

182 Views

•

03:58 min

•

August 18th, 2023

DOI :

10.3791/200887-v

August 18th, 2023

•

Cheng-Yang Zhang*¹^,², Xiao-Feng Zhang*³, Jun Yuan*¹^,², Yuan-Feng Gong⁴, Hui Tang⁴, Wan-Yu Guo¹^,², Tong-Yan Li¹^,², Cai-Wen Li¹^,², Yun-Qiang Tang⁴, Ning-Fang Ma¹^,², Ming Liu¹^,²

¹Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, ²Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Center for Cancer Research and Translational Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, ³Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, ⁴Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Cancer Hospital, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

Transcript

כדי לבצע ציפוי אורגנואידים, ראשית, להסיר את supernatant מן הצנטריפוגה ושטף תאי קרצינומה hepatocellular. להשעות מחדש את התאים ב 50 מיקרוליטר של תמצית קרום מרתף, או BME, לכל באר, עבור ציפוי. לאחר מכן, השהה את התאים ב- DMEM/F12 מתקדם.

לאחר מכן פיפטה בעדינות את צברי התא עד שנראה תרחיף אחיד. הוסף BME לתרחיף, וודא כי ריכוז BME הוא בין 30 ל 50% זרע 50 מיקרוליטר של טיפות BME עם אשכולות תאים במרכז צלחת 24 באר. הניחו לטיפות להתמצק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום שחומם מראש לכל באר ודגרים באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. רעננו את מדיום התרבות כל יומיים-שלושה. לאחר שבועיים, החלף את מדיום הבידוד בתווך הרחבת האורגנואידים.

לאחר שבעה עד 10 ימים של תרבית, ברגע שהאורגנואידים הגיעו לצפיפות המתאימה, מעבדים את התרביות לפי הצורך. כדי לעבור את האורגנואידים, תחילה חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח בעלי חיבור נמוך במיוחד באינקובטור. לאחר מכן, הפשירו את ה-BME הקפוא למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עד ממש לפני השימוש.

מחממים מראש את תמיסת קציר האורגנואידים ותחליף טריפסין בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שלב ההכנה, מוציאים את מדיום התרבית מצלחת תרבית האורגנואידים. לאחר מכן להעביר את ההשעיה אורגנואיד לתוך צינור 15 מיליליטר.

כעת הוסף תמיסת קציר אורגנואידים ביחס לכמות BME. כדי לערבב את המתלים, השתמש באקדח פיפטה 1000 מיקרוליטר כדי לגרד ופיפטה למעלה ולמטה. לאחר הדגירה על הצינור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, השתמש פיפטה של מיליליטר אחד כדי לשאוף בזהירות את BME.

ודא כי BME מומס לחלוטין. עקוב אחר התמצית כל 10 דקות עד שנראה צביר תאים אורגנואיד ברור. ואז צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 400 גרם במשך חמש דקות.

הסירו כמה שיותר מהסופרנאטנט. כדי להתחיל בעיכול אנזימטי של אורגנואידים קרצינומה hepatocellular, להוסיף אחד עד חמישה מיליליטר של תחליף טריפסין שחומם מראש לגלולת אורגנואיד בתרבית. לדגור על המתלה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.

השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא אם אורגנואידים מתנתקים לצבירים קטנים של שניים עד 10 תאים. כדי לעצור את העיכול, להוסיף נפח מתאים של מדיום בסיסי קר. לאחר מכן צנטריפוגו את האורגנואידים ב 400 גרם במשך חמש דקות בשמונה מעלות צלזיוס.

בזהירות להסיר כמה שיותר supernatant. השהה מחדש את מספר האורגנואידים הרצוי במטריצה המתאימה לציפוי. כל 10 ימים עוברים האורגנואידים, בהתאם לצפיפות צמיחת האורגנואידים.

ספרואידים של אורגנואידים HCC נצפו תוך שלושה ימים מהתרבית. ספרואידים קומפקטיים עם קצוות מעוגלים וציטוזול חדיר נראו ביום הראשון להקמה. אורגנואידים היו בגודל דומה והיו בעלי הקוטר הגדול ביותר כאשר גודלו בתרבית ב-30% עד 50% BME.

ה-BME היה המקוטע ביותר ב-10% וכתוצאה מכך האורגנואידים הקטנים ביותר. ה-BME היה שלם ביותר ב-100%, אך התוצאה הייתה אורגנואידים בקוטר בינוני. אורגנואיד HCC המתפשט הגיע לגודל העולה על 500 מיקרומטר בכל תרבית לאחר שלושה דורות.

אורגנואידים HCC בגודל משמעותי של יותר מ -1000 מיקרומטר התקבלו בתוך תקופת תרבית של 20 יום.

Explore More Videos

Hepatocellular Carcinoma